絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶SRPK2在小鼠睪丸組織中的表達及意義

楊紅,李曉賓,李婷,賈三三,王海龍,宋國華,郭睿*

(1. 山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室, 太原　030001;

2. 山西醫(yī)科大學寄生蟲學教研室, 太原　030001;

3. 山西醫(yī)科大學實驗動物中心，太原　030001.)

?

絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶SRPK2在小鼠睪丸組織中的表達及意義

楊紅1, 李曉賓1, 李婷1, 賈三三1, 王海龍2, 宋國華3,郭睿1*

(1. 山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室, 太原030001;

2. 山西醫(yī)科大學寄生蟲學教研室, 太原030001;

3. 山西醫(yī)科大學實驗動物中心，太原030001.)

【摘要】目的通過研究絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2，SRPK2) 基因mRNA及其編碼蛋白產(chǎn)物在小鼠睪丸組織中的表達特征，探討該基因在精子發(fā)生過程中的作用及意義。 方法分別采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白免疫印跡雜交(Western blotting)分析該基因mRNA及蛋白產(chǎn)物在小鼠多種組織中的表達；利用實時定量PCR(real-time quantitative PCR)分析SRPK2 mRNA在不同發(fā)育階段小鼠睪丸組織中的差異表達；應用免疫組織化學染色和間接免疫熒光技術觀察SRPK2蛋白在小鼠曲精小管中的細胞定位和生精細胞內(nèi)的亞細胞定位。 結果半定量RT-PCR和Western blotting分析顯示SRPK2 mRNA和蛋白在小鼠睪丸組織中均大量表達；實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)SRPK2 mRNA在5周及8周齡雄性小鼠睪丸組織中顯著表達，具有明顯的階段特異性表達特征。免疫組織化學染色結果表明SRPK2蛋白陽性著色主要位于曲精小管中的長形精子細胞核；間接免疫熒光分析顯示SRPK2蛋白定位于長形精子細胞核表面。 結論SRPK2基因在小鼠睪丸組織中大量表達，并且具有顯著的階段特異性表達特征和明確的細胞核定位，極有可能在小鼠精子發(fā)生的變態(tài)成形期參與mRNA前體分子的剪接過程，其作用機制值得進一步深入研究。

【關鍵詞】SRPK2；精子發(fā)生；小鼠

Expression and significance of SR-protein-specific

哺乳動物的精子發(fā)生是一個極其復雜而特異的細胞分化過程，分為有絲分裂期、減數(shù)分裂期和變態(tài)成形期。其中，精子細胞的變態(tài)成形是一個關鍵環(huán)節(jié)，也是體內(nèi)其他任何細胞不具備的獨特現(xiàn)象。在變態(tài)成形階段，單倍體圓形精子細胞需要經(jīng)過復雜的變態(tài)分化，才能發(fā)育為具有頭、頸、尾結構的特異精子。主要的形態(tài)學改變包括：核染色體緊密包裝，細胞核濃縮變長，高爾基體衍變成為頂體，以微管和肌動蛋白為主的精尾形成。精子細胞這一特殊的分化方式必定受到多種因素的精確調(diào)控，探討其內(nèi)在過程及參與分子的功能將有助于進一步認識精子發(fā)生的生物學機制。

精子發(fā)生相關蛋白3(spermatogenesis-associated protein 3，SPATA3)基因是近年發(fā)現(xiàn)的睪丸組織特異高表達基因，國外學者應用基因芯片技術證實該基因在人類非梗阻性無精子癥患者睪丸組織中的表達顯著降低，可作為該類男性不育癥的潛在分子標志用于臨床診斷[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)小鼠spata3基因在5周和8周齡小鼠睪丸組織中高度表達，可能參與精子發(fā)生后期精子細胞的變態(tài)成形過程[2]。以小鼠spata3基因cDNA全長構建誘餌質粒，從蛋白水平出發(fā)采用酵母雙雜交技術篩選小鼠睪丸cDNA文庫，獲得了與spata3存在相互作用的絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2，SRPK2)。SRPK2蛋白屬于SRPK激酶家族，能夠磷酸化富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子蛋白，從而參與調(diào)節(jié)細胞核內(nèi)mRNA前體的剪接加工[3]。有實驗表明SRPK2主要在腦組織和睪丸組織大量表達[4]，但目前絕大多數(shù)關于SRPK2的研究集中在腦組織，在睪丸組織中的表達研究鮮有報道。為了深入探討SRPK2在精子發(fā)生過程中的作用，分別從mRNA和蛋白水平分析SRPK2在小鼠睪丸組織中的表達特性，為后續(xù)研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物

SPF級BALB/c雄性小鼠，1周齡10只，體重2～4 g；2周齡6只，體重4～8 g；3周齡2只，體重8～12 g；5周齡1只，體重17～20 g；8周齡2只，體重20～25 g，均由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供【SCXK(晉)2009-0001】，組織取材于山西醫(yī)科大學實驗動物中心實驗室完成【SYXK(晉)2003-0003】，并按照實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2引物序列

根據(jù)SRPK2編碼基因(基因登錄號：NM_009274.2)序列設計引物，上游引物為5′-GCTACAGCACACCTGCAGACA-3′，下游引物為5′-CAGAATGCGGTTCGAACAAATAG-3′，擴增產(chǎn)物大小為87 bp。實驗以β-actin為內(nèi)參照，上游引物為5′-CTATTGGCAACGAGCGGT-3′，下游引物為5′-GGTCTTTACGGATGTCAACG-3′，擴增產(chǎn)物大小為132 bp。上述引物均由TaKaRa公司合成。

1.3主要試劑

RNA提取Trizol試劑和抗淬滅封片劑由Invitrogen公司提供，HiFi-MMLV反轉錄試劑盒、PCR試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液均為北京康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品，SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ購自寶生物工程(大連)有限公司，BSA、封閉用正常山羊血清為Solarbio公司產(chǎn)品，小鼠抗β-actin單克隆抗體、SRPK2兔抗多克隆抗體購自Biorbyt公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG由北京中杉金橋有限公司提供，Cy3標記驢抗兔熒光二抗由Jackson公司提供，通用型免疫組化試劑盒為武漢博士德生物公司產(chǎn)品。

1.4半定量RT-PCR分析SRPK2 mRNA的組織特異性表達

頸椎脫臼處死8周齡雄性小鼠，迅速取出其心、肝、腦、腎、脾、肺和睪丸組織置于液氮中，加入適量Trizol試劑提取小鼠各組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測后，取2 μg進行RT-PCR分析，擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)。同時以管家基因β-actin作為內(nèi)參照，反應結束后，經(jīng)2.0 %瓊脂糖凝膠電泳分析檢測擴增產(chǎn)物。

1.5Western blotting分析SRPK2蛋白在各組織中的表達水平

頸椎脫臼處死8周齡雄性小鼠，提取心、肝、腦、腎、脾、肺和睪丸組織總蛋白，并采用BCA法進行蛋白定量。各取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳分離后，經(jīng)轉膜、封閉，分別以小鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶1000)及兔抗SRPK2多克隆抗體(1∶100)為一抗4℃雜交過夜，次日以山羊抗小鼠HRP-IgG(1∶5000)、山羊抗兔HRP-IgG(1∶5000)為二抗，室溫雜交1 h，采用ECL發(fā)光法檢測，通過BIO-RAD凝聚成像儀分析結果。

1.6實時定量PCR檢測SRPK2 mRNA的階段特異性表達

分別提取1、2、3、5和8周齡雄性小鼠睪丸組織總RNA，反轉錄合成cDNA，使用SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒進行實時定量PCR檢測。反應采取兩步法，每個樣品均設立三個平行管，具體擴增條件為：95℃預變性10 min；95℃ 15 s，57℃ 1 min，共進行40個循環(huán)。每次反應均設置熔解曲線分析，以證實無非特異性擴增，同時以管家基因β-actin作為內(nèi)參照。SRPK2基因的相對表達量計算采用ΔΔCT法，以3周齡睪丸組織中該基因的表達量為參照，取值為1。

1.7免疫組織化學染色顯示SRPK2蛋白在曲精小管中的細胞定位

取8周齡雄性小鼠睪丸組織，經(jīng)4 %多聚甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚5 μm)，裱片于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，溫箱烘干。免疫組織化學檢測采用ABC法，滴加兔抗SRPK2多克隆抗體(1∶100)4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，次日滴加生物素標記的山羊抗兔二抗(1∶200)室溫孵育1 h，滴加ABC復合液后37℃濕盒內(nèi)溫育30 min，常規(guī)DAB顯色，蘇木素復染(同時選取數(shù)張不進行復染)、脫水、透明、封片，鏡下觀察結果，結果判定以出現(xiàn)棕黃色著色為陽性染色。實驗同時以PBS代替一抗作為陰性對照，所有實驗均重復3次。

1.8間接免疫熒光染色分析SRPK2蛋白在生精細胞中的亞細胞定位

取8周齡雄性小鼠睪丸組織置于預冷的PBS中，快速分離曲精小管，并使用膠原酶消化成為散在的單細胞，取50 μL涂片，室溫晾干。封閉后滴加兔抗SRPK2多克隆抗體(1∶100)，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，次日滴加Cy3標記的驢抗兔二抗(1∶400)37℃孵育2 h，充分洗滌后滴加20 μL含DAPI的抗淬滅封片劑，避光，立即在共聚焦激光顯微鏡下觀察并攝片。上述實驗均重復3次，同時以1% BSA/PBS代替一抗作為陰性對照。

2結果

2.1SRPK2 mRNA在小鼠多種組織中的半定量RT-PCR分析

以雄性小鼠7種組織(心、肝、腦、腎、脾、肺、睪丸)總RNA為模板進行半定量RT-PCR擴增，所得產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，結果見圖1?？梢奡RPK2基因mRNA在小鼠睪丸組織中的擴增條帶尤為明顯，經(jīng)過灰度掃描，以β-actin基因的表達量作為參照，計算該基因在不同組織中的相對表達量(見圖2)，結果表明SRPK2基因mRNA在小鼠睪丸組織中的表達量最高，其次在腎臟和腦組織中也有一定強度表達，而其他組織的表達則相對較弱甚至缺如。

注:M. Marker； 1.心； 2.肝； 3.脾； 4.腦； 5.腎； 6.肺； 7.睪丸?！　D1　SRPK2基因在小鼠不同組織中RT-PCR結果Note.M. Marker; 1. Hheart; 2. Lliver; 3. Sspleen; 4. Bbrain; 5. Kkidney; 6. Llung; 7. Ttestis.　　Fig.1　The RT-PCR analysis of SRPK2 in several organ-tissues of BALB/c mice

注:1.心； 2.肝； 3.脾； 4.腦； 5.腎； 6.肺； 7.睪丸?！　D2　SRPK2 mRNA在不同組織中的相對表達Note.1. Heart; 2. Liver; 3. Spleen; 4. Brain; 5. Kidney; 6. Lung; 7. Testis.　　Fig.2　Relative expression of SRPK2 mRNA in different tissues of the mice

2.2Western blotting分析SRPK2蛋白在小鼠不同組織中的表達

Western blotting結果(圖3)顯示目的條帶約55 ×103，與預期大小基本一致。睪丸組織對應的陽性條帶最為顯著，腦組織和腎臟中SRPK2蛋白陽性條帶也比較明顯，而其他組織未檢測到該基因產(chǎn)物的表達。以β-actin蛋白表達量作為參照，利用凝膠分析軟件進行掃描，計算SRPK2/β-actin灰度比值，用來表示SRPK2蛋白在各組織中的相對表達量。計算結果表明睪丸組織中SRPK2蛋白的表達量為2.613，腎臟和腦組織中該蛋白的表達量分別為1.235和1.038。

2.3實時定量PCR檢測SRPK2 mRNA在小鼠不同發(fā)育階段睪丸組織中的表達

注:　1.心； 2.肝； 3.脾； 4.腦； 5.腎； 6.肺； 7.睪丸?！　D3　Western blotting 檢測SRPK2蛋白在小鼠不同組織中的表達Note.1. Heart; 2. Liver; 3. Spleen; 4. Brain; 5. Kidney; 6. Lung; 7. Testis.　　Fig.3　Expression of SRPK2 protein in different tissues by Western blotting

圖4　實時定量PCR分析SRPK2 mRNA的階段特異性表達　　Fig.4　Stage-specific expression of SRPK2 mRNA detected by real-time quantitative PCR

通過實時定量PCR分析SRPK2 mRNA在不同發(fā)育階段小鼠睪丸組織中的相對表達量(見圖4)，結果顯示SRPK2 mRNA的表達趨勢呈規(guī)律性增強。設定該基因在3周齡小鼠睪丸組織中的表達量為1，可見在1周和2周齡小鼠睪丸中的表達很弱，后逐漸增強，5周齡和8周齡時SRPK2的表達水平分別約為3周齡的2.6 和2.7倍。2.4免疫組化染色檢測SRPK2蛋白在曲精小管中的細胞定位圖5為免疫組化染色結果，可以看到SRPK2蛋白陽性信號呈棕黃色顆粒，主要分布在曲精小管內(nèi)長形精子細胞的細胞核區(qū)域，精原細胞、精母細胞以及圓形精子細胞中未見明顯的陽性信號存在。

2.5間接免疫熒光染色檢測SRPK2蛋白在生精細胞中的亞細胞定位

利用間接免疫熒光染色技術檢測SRPK2蛋白的亞細胞定位，結果見圖6所示。在多種類型細胞混雜存在的視野中，可以看到紅色熒光標記的SRPK2蛋白只在長形精子細胞核附近的位置表現(xiàn)出強烈的陽性信號，其他細胞未見明顯的陽性著色(B、D)。從F能夠明顯看到SRPK2蛋白紅色熒光信號呈“彎月狀”緊密附著在長形精子細胞核凸起側，并靠近精子頭部。

注：A. SRPK2蛋白的細胞定位,蘇木素復染；B. SRPK2蛋白的細胞定位,未復染；C. 陰性對照。　　圖5　SRPK2蛋白在小鼠睪丸曲精小管中的免疫組化染色Note. A. Ccellular localization of SRPK2 protein, hematoxylin staining; B. Ccellular localization of SRPK2 protein, No restained with hematoxylin; C. Negative control.　　Fig.5　Immunohistochemical staining of SRPK2 protein in seminiferous tubules of the mouse testis

注：A, C, E. DAPI染色；B, D, F. 組合圖?！　D6　間接免疫熒光染色顯示SRPK2蛋白在生精細胞中的定位Note.：A, C, E. DAPI staining; B, D, F. The merge of DAPI and Cy3 staining.　　Fig.6　Localization of SRPK2 protein in spermatic cells by indirect immunofluorescence staining

3討論

哺乳動物的精子發(fā)生受到一系列因素的協(xié)同調(diào)節(jié)，只有在特定基因精密而嚴格的調(diào)控下，才能產(chǎn)生具有頭、頸、尾結構的特異精子，輸出到附睪獲得授精能力。如果這一過程相關的關鍵基因缺陷、突變或表達異常，都有可能使精子細胞不能完成正常的分化過程，從而導致精子生成障礙，引起雄性動物不育。近年來，許多研究人員借助基因敲除小鼠模型已經(jīng)證實，與精子細胞變態(tài)成形相關的重要基因缺失將直接導致精子發(fā)生停滯在變態(tài)成形期，致使成熟精子數(shù)目減少。這類基因主要包括 selenium、Atg7、Iqcg、RNASE9、PA-PLA1、CHD5、Taf7l、Trf2、KIF3A等[5～12]?？v觀這些基因在小鼠睪丸組織中的表達特征，可以發(fā)現(xiàn)它們都具有嚴格的階段特異性表達，大多在減數(shù)分裂完成后的圓形精子細胞階段含量豐富。這也間接說明這類基因在圓形精子細胞分化成為長形精子細胞，以及成熟精子的過程中發(fā)揮了積極作用。因此，發(fā)現(xiàn)和鑒定類似基因對深入研究精子細胞變態(tài)成形的分子機制及由于精子發(fā)生異常引起的男性不育癥具有深遠的現(xiàn)實意義。

SPATA3在精子發(fā)生過程中具有與上述基因相似的階段特異表達特征，推測該基因可能參與了精子細胞的變態(tài)成形。以SPATA3為誘餌，通過酵母雙雜交技術篩選獲得了SRPK2。據(jù)文獻報道，SRPK2激酶能夠催化靶蛋白特異部位的絲氨酸發(fā)生磷酸化，從而調(diào)節(jié)富含絲氨酸/精氨酸蛋白(常被稱為SR蛋白)的活性。SR蛋白屬于RNA結合蛋白，能夠作為剪接因子參與形成剪接體，協(xié)助完成細胞核內(nèi)mRNA前體的剪接加工，轉變成為成熟mRNA，進入胞漿發(fā)揮翻譯模板的作用[3]。因此，活化的SR蛋白能夠促進mRNA成熟，繼而加速新蛋白的合成。但SR蛋白本身并無活性，需要SRPK磷酸化其特異位點的絲氨酸才能將之激活。

SRPK家族包括SRPK1和SRPK2，Northern blotting結果顯示二者在睪丸組織均有大量表達[4, 13, 14]，并且研究者通過原位雜交實驗表明SRPK1蛋白存在于小鼠睪丸曲精小管多種生精細胞內(nèi)，但關于SRPK2蛋白的細胞定位至今未見有研究論文發(fā)表。實驗利用半定量RT-PCR證實SRPK2 mRNA在睪丸組織大量表達，Western blotting結果也顯示SRPK2蛋白在睪丸組織含量豐富，分別從mRNA和蛋白水平驗證了其他研究者的結論。另外，還利用不同周齡小鼠睪丸組織為實驗材料，通過實時定量PCR檢測了SRPK2 mRNA的階段特異性表達。結果表明SRPK2 mRNA在5周齡和8周齡小鼠睪丸中的表達水平遠遠高于其他階段，提示該基因主要在精子發(fā)生的中、后期大量表達。5周齡小鼠睪丸曲精小管中已出現(xiàn)較多數(shù)量的圓形精子細胞；8周齡中有40%的生精細胞是長形精子細胞[15]。為了確定SRPK2蛋白在各類生精細胞中的定位，進一步應用免疫組化和免疫熒光染色觀察了該蛋白的表達情況。從最終的染色結果可以清楚地看到SRPK2蛋白定位在曲精小管內(nèi)部靠近管腔的長形精子細胞核部位，并且在長形精子核頭部凸起側有大量分布。結合上述實驗所得，能夠判斷SRPK2 mRNA在小鼠精子發(fā)生過程中具有明顯的階段特異性表達特征， SRPK2蛋白在小鼠精子發(fā)生后期高度表達，主要存在于長形精子細胞內(nèi)。

生物信息學分析是目前預測基因及蛋白功能非常有效的手段之一。經(jīng)過比對分析發(fā)現(xiàn)，小鼠SRPK2激酶的多肽鏈序列與SRPK1非常相似，其激酶區(qū)域的氨基酸種類與SRPK1有77%是完全相同的[14]。因此，這兩種激酶擁有相同的催化功能，都能使SR蛋白特異位點的絲氨酸磷酸化。但SRPK2還具有SRPK1不存在的兩個獨特區(qū)域：氨基末端第21～43位氨基酸之間有脯氨酸富集區(qū)，肽鏈中部第287～405位氨基酸序列中有豐富的酸性氨基酸大量存在[4, 13]。由此決定了二者的部分理化性質和催化底物的種類有所差別[16]，在細胞內(nèi)參與的生物學過程和存在的意義可能不盡相同?；蛟S，這正是SRPK1與SRPK2同時在睪丸組織大量表達，但SRPK1存在于多種生精細胞，而SRPK2主要存在于長形精子細胞的根本原因。在圓形精子細胞分化為成熟精子的過程中，需要大量mRNA與蛋白質不斷合成，因此，這一階段mRNA前體的剪接加工活動非?；钴S，而各種剪接因子正確組裝形成剪接體是必不可少的前提條件。課題組曾采用質譜技術在變態(tài)成形期的精子細胞中檢測到60多種蛋白均參與了剪接體的組裝過程[17]，其中的SR蛋白必須首先被SRPK磷酸化激活才能參與形成剪接體，這可能就是SRPK2蛋白在長形精子細胞大量存在的意義所在。但關于SRPK2在精子細胞變態(tài)成形過程中的具體作用及其作用機制仍需進一步深入研究。

參考文獻

[1]Malcher A, Rozwadowska N, Stokowy T, et al. Potential biomarkers of nonobstructive azoospermia identified in microarray gene expression analysis [J]. Fertil Steril, 2013, 100(6):1686-1694.

[2]李喜霞, 張棟, 郭睿, 等. 小鼠生精細胞發(fā)育特異基因spata3的表達分析和克隆純化 [J].中國組織工程研究與臨床康復, 2009, 13(11): 2024-2029.

[3]Hong Y, Jang SW, Ye K. The N-terminal fragment from caspase-cleaved serine/arginine protein-specific kinase2 (SRPK2) translocates into the nucleus and promotes apoptosis [J]. J Biol Chem. 2011, 286(1): 777-786.

[4]Kuroyanagi N, Onogi H, Wakabayashi T, et al. Novel SR-protein-specific kinase, SRPK2, disassembles nuclear speckles [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1998, 242(2): 357-364.

[5]Ahsan U, Kamran Z, Raza I, et al. Role of selenium in male reproduction [J]. Anim Reprod Sci, 2014, 146(1-2): 55-62.

[6]Wang H, Wan H, Li X, et al. Atg7 is required for acrosome biogenesis during spermatogenesis in mice [J]. Cell Res. 2014, 24(7): 852-869.

[7]Li RK, Tan JL, Chen LT, et al. Iqcg is essential for sperm flagellum formation in mice [J]. PLoS ONE. 2014, 9(5): e98053.

[8]Westmuckett AD, Nguyen EB, Herlea-Pana OM, et al. Impaired sperm maturation in RNASE9 knockout mice [J]. Biol Reprod. 2014, 90(6): 1-10.

[9]Baba T, Kashiwagi Y, Arimitsu N, et al. Phosphatidic acid (PA)-preferring phospholipase A1 regulates mitochondrial dynamics [J]. J Biol Chem, 2014, 289(16): 11497-11511.

[10]Zhuang T, Hess RA, Kolla V, et al. CHD5 is required for spermiogenesis and chromatin condensation [J]. Mech Dev, 2014, 131: 35-46.

[11]Zhou H, Grubisic I, Zheng K, et al. Taf7l cooperates with Trf2 to regulate spermiogenesis [J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013, 110(42): 16886-16891.

[12]Lehti MS, Kotaja N, Sironen A. KIF3A is essential for sperm tail formation and manchette function [J]. Mol Cell Endocrinol. 2013, 377(1-2): 44-55.

[13]Wang HY, Lin W, Dyck JA, et al. SRPK2: a differentially expressed SR protein-specific kinase involved in mediating the interaction and localization of pre-mRNA splicing factors in mammalian cells [J]. J Cell Biol, 1998, 140(4): 737-750.

[14]Papoutsopoulou S, Nikolakaki E, Chalepakis G, et al. SR protein-specific kinase 1 is highly expressed in testis and phosphorylates protamine 1 [J]. Nucleic Acids Res. 1999, 27(14): 2972-2980.

[15]Yu ZR, Guo R, Ge YH, et al. Gene expression profiles in different stages of mouse spermatogenic cells during spermatogenesis [J]. Biol Reprod, 2003, 69: 37-47.

[16]Liang N, Zeng C, Tao KP, et al. Primary structural features of SR-like protein acinus S govern the phosphorylation mechanism by SRPK2 [J]. Biochem J. 2014, 459(1): 181-191.

[17]Wang H, Li Y, Yang L, et al. Mass spectrometry-based, label-free quantitative proteomics of round spermatids in mice [J]. Mol Med Rep. 2014, 10(4): 2009-2024.

·會訊·

中英第二屆實驗動物福利倫理國際論壇隆重召開

由中國實驗動物學會實驗動物福利倫理專業(yè)委員會和英國內(nèi)政部共同主辦的"中英第二屆實驗動物福利倫理國際論壇"于2015年3月17日至19日在北京裕龍國際酒店隆重召開。

3月18日上午，論壇舉行了開幕式。開幕式由論壇執(zhí)行主席、中國實驗動物學會實驗動物福利倫理專業(yè)委員會主任委員孫德明教授主持?？萍疾恐袊r(nóng)村技術開發(fā)中心賈敬敦主任、英國使館科技創(chuàng)新處凱倫處長等領導出席論壇并發(fā)表了熱情洋溢的講話。中國實驗動物學會理事長秦川教授委托出席會議的學會常務副秘書長宋晶女士發(fā)表致辭。來自國內(nèi)外近200名專家學者參加了論壇。

本次論壇以“提升實驗動物福利倫理管理規(guī)范和科技水平”為宗旨，從實驗動物福利倫理管理法規(guī)與技術標準及進展、善待實驗動物、動物保護和3R理念如何實踐、實驗動物的疼痛管理、麻醉鎮(zhèn)痛、福利倫理審查中的利弊分析、仁慈終點、替代技術、環(huán)境豐富、福利倫理認證等相關的國際合作議題進行廣泛而深入的探討，通過借鑒國際公認的管理經(jīng)驗和先進的科技成果，以期推動中國實驗動物福利倫理管理和科技水平的快速提升。

論壇將于今日結束，更多詳情請關注后續(xù)報道及中國實驗動物學會網(wǎng)站發(fā)布的信息。

中國實驗動物學會秘書處供稿

研究報告

kinase SRPK2 in mouse testis

YANG Hong1, LI Xiao-bin1, LI Ting1, JIA San-san1, WANG Hai-long2,

SONG Guo-hua3, GUO Rui1

(1. Department of Biochemistry and Molecular Biology, 2. Department of Parasitology,

3. Laboratory Animal Center, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

【Abstract】ObjectiveTo analyze the expression characteristics of SRPK2 (serine / arginine-rich protein specific kinase 2 mRNA and its encoded protein products in mouse testis, and to reveal its molecular role during spermatogenesis. Methods Using semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting to analyze the expression of SRPK2 mRNA and its protein products in several mouse tissues. The stage-specific expression pattern of SRPK2 mRNA in mouse testis was examined by real-time quantitative PCR. Immunohistochemical staining was applied to identify the SRPK2 protein distribution in mouse testicular seminiferous tubules and indirect immunofluorescence staining was used to detect the subcellular localization of SRPK2 protein in spermatic cells. ResultsSemi-quantitative RT-PCR and Western blotting analysis revealed that SRPK2 was highly expressed in mice testis. Real-time quantitative PCR analysis showed that SRPK2 mRNA was expressed abundantly at the stage of 5-and 8-week old mouse testes, suggesting that SRPK2 gene has stage-specific expression patterns during mouse spermatogenesis. Immunohistochemical and indirect immunofluorescence staining demonstrated that SRPK2 protein was located around the surface of elongated sperm nucleus. ConclusionsSRPK2 is highly expressed in mouse testis and has significant stage-specific expression characteristics with distinct nuclear localization. These results indicate that SRPK2 may participate in precursor mRNA splicing during mouse spermiogenesis. The molecular mechanism of SRPK2 is yet to be further studied.

【Key words】SRPK2; Spermatogenesis; Mouse; Testis

[收稿日期]2014-09-17

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2015.02.013

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847(2015) 02-0171-07

[通訊作者]郭睿，女，碩士研究生導師，主要研究方向：發(fā)育生物學。E-mail： guoruipumc@aliyun.com

[作者簡介]楊紅(1990年-)，碩士研究生在讀，主要研究方向：生殖細胞基因表達調(diào)控。E-mail： qianxiasx@126.com

[基金項目]山西省回國留學人員科研資助項目(NO.2011-043)。