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    江漢雞群體FSHβ 基因遺傳多態(tài)位點(diǎn)分析

    2022-01-08 11:43:40潘愛鑾蒲躍進(jìn)梁振華杜金平朱昌友皮勁松
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年23期
    關(guān)鍵詞:遺傳變異江漢元件

    黃 濤,潘愛鑾,申 杰,吳 艷,蒲躍進(jìn),張 昊,孫 靜,梁振華,杜金平,朱昌友,皮勁松

    (1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心/動(dòng)物胚胎與分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430064;2.湖北省畜牧良種場(chǎng),武漢 434010)

    江漢雞為中國地方品種,是湖北省非常重要的地方雞遺傳資源。江漢雞是在江漢平原上進(jìn)化長(zhǎng)時(shí)間馴化而成的,具有自身明顯的特征,以黃麻羽居多,體重較輕,屬蛋肉兼用型,自然群體里有部分雞產(chǎn)綠殼蛋[1]。雖然江漢雞具有產(chǎn)品品質(zhì)好、抗逆性強(qiáng)、耐粗飼等優(yōu)點(diǎn),但也存在一些不足,主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)速度較慢、產(chǎn)蛋少、飼料轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)成本高[2]。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所家禽試驗(yàn)場(chǎng)開展對(duì)江漢雞的保種與開發(fā)利用工作,基于江漢雞的配套利用[3]進(jìn)行選育,挖掘江漢雞遺傳特色是對(duì)其進(jìn)行開發(fā)利用的緊迫任務(wù),獲取江漢雞群體遺傳變異信息,對(duì)功能位點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選或許有利于今后的開發(fā)利用。

    卵泡雌激素(FSH)是促卵泡素(Follicle stimulating hormone,F(xiàn)SH),由垂體前葉分泌,是一種糖蛋白激素。FSH 分子是由α 和β 2 個(gè)亞基組成的異質(zhì)二聚體,當(dāng)β 亞基與α 亞基結(jié)合時(shí)其才具有生物學(xué)活性[4]。FSHβ基因?qū)﹄u性成熟和生殖等具有調(diào)控作用,能刺激卵泡發(fā)育和成熟,產(chǎn)生雌激素和促進(jìn)排卵。李江曼[5]在不同品種雞的FSHβ基因檢測(cè)到單堿基突變位點(diǎn)與寧都黃雞的產(chǎn)蛋性能顯著相關(guān);秦玉梅等[6]在雞FSHβ基因中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與玫瑰冠雞和海蘭褐蛋雞300 日齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關(guān)。本研究基于基因組重測(cè)序結(jié)果鑒定江漢雞群體FSHβ基因的遺傳變異信息,通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)功能性變異位點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)樣品

    江漢雞來源于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所家禽試驗(yàn)雞場(chǎng)。在18 周齡時(shí)隨機(jī)抽取30 只進(jìn)行腋下采血,于抗凝管中保存。DNA的提取采用天根DNA 提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit)進(jìn)行,提取的DNA 用NanoDrop 2 000 進(jìn)行濃度測(cè)定。將各樣品稀釋到100 ng/μL,然后每個(gè)樣品取3 μL進(jìn)行混池。

    1.2 重測(cè)序分析

    DNA 樣品送往百易匯能公司進(jìn)行建庫測(cè)序。在獲取原始數(shù)據(jù)后,首先使用cutadapt 軟件進(jìn)行clean reads 操作。下載Galgal6 參考基因組,使用bwa 軟件建立索引。運(yùn)用SAMtools 軟件對(duì)clean reads 進(jìn)行序列比對(duì)組裝。生成Bam 文件,建立索引后導(dǎo)入IGV軟件中收集變異位點(diǎn)。使用GATK 軟件對(duì)bam 文件進(jìn)行變異位點(diǎn)整理生成vcf文件,該文件里包含基因組遺傳變異信息。

    1.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

    針對(duì)FSHβ基因序列中的遺傳變異,篩選潛在的功能性變異。分析內(nèi)容包括3 個(gè)部分,分別為M6A 分析、調(diào)控元件分析和miRNA 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。設(shè)定mRNA(NM_204257.1)序列第一個(gè)堿基為+1。使用RNAfold web server 進(jìn)行cds 區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析;使用SRAMP(http://www.cuilab.cn/sramp/)在線軟件對(duì)序列進(jìn)行M6A 分析;在對(duì)調(diào)控元件進(jìn)行分析時(shí),采用JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)在線分析軟件,設(shè)置置信參數(shù)大于85。在對(duì)miRNA 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析時(shí),采用miRDB(http://mirdb.org/)在線軟件進(jìn)行分析,保留target score為60以上的結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 江漢雞群體FSHβ 基因遺傳變異

    基于基因組重測(cè)序數(shù)據(jù),獲取江漢雞群體FSHβ基因所有遺傳變異信息(圖1、圖2)。FSHβ基因包括有2 個(gè)內(nèi)含子和3 個(gè)外顯子。外顯子又可以分為5′utr、cds和3′utr。本研究在江漢雞群體中發(fā)現(xiàn)該基因共有35 個(gè)SNPs 和2 個(gè)indels。其中外顯子有31個(gè)SNPs,其分布為5′utr 區(qū)0 個(gè),cds 區(qū)2 個(gè),3′utr 區(qū)29 個(gè);內(nèi)含子有4 個(gè)SNPs。此外,發(fā)現(xiàn)的2 個(gè)indels位于3′utr區(qū)。

    圖1 江漢雞群體FSHβ 基因內(nèi)遺傳變異信息統(tǒng)計(jì)

    圖2 江漢雞FSHβ 基因內(nèi)出現(xiàn)6 個(gè)連續(xù)堿基indel(紅框)

    2.2 FSHβ 蛋白結(jié)構(gòu)分析

    在江漢雞中發(fā)現(xiàn)位于FSHβ基因cds 區(qū)有2 個(gè)SNPs,位于+297 位置G 突變成A,屬于非同義突變,造成其由甘氨酸變成絲氨酸。位于+431 位置C 突變成T,屬于同義突變,未發(fā)生氨基酸變化。比較非同義突變對(duì)RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),G 突變成A 自由能由-441.29 kJ/mol 變?yōu)?444.22 kJ/mol,C突變成T自由能由-441.29 kJ/mol變?yōu)?441.71 kJ/mol。+297 和+431 位點(diǎn) 突變 前后cds 區(qū)RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況見圖3。甘氨酸突變成絲氨酸,蛋白質(zhì)分子式由C643H967N161O203S17變成C644H969N161O204S17??偲骄H水性由-0.069 變成-0.072,不穩(wěn)定指數(shù)和理論等電點(diǎn)未發(fā)生變化。

    圖3 突變對(duì)FSHβ 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

    2.3 FSHβ 基因M6A 分析

    使用SRAMP 在線軟件對(duì)FSHβ的mRNA(NM_204257.1)序列進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)M6A 修飾位點(diǎn)。結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)錄本內(nèi)有10 個(gè)潛在的M6A 修飾位點(diǎn),對(duì)應(yīng)的位置分別在+110、+152、+376、+392、+518、+1398、+1408、+1684、+1691、+1874。其中,1 個(gè)位點(diǎn)具有極高置信度(very high confidence),5 個(gè)位點(diǎn)具有高置信度(high confidence),3 個(gè)位點(diǎn)具有中置信度(moderate confidence),1 個(gè)位點(diǎn)具有低置信度(low confidence),這10 個(gè)位點(diǎn)在江漢雞群體中沒有發(fā)生遺傳變異。

    2.4 FSHβ 基因調(diào)控元件預(yù)測(cè)分析

    使用JASPAR 在線軟件對(duì)FSHβ的mRNA(NM_204257.1)序列進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在設(shè)置置信參數(shù)為85%后,獲取70 個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控元件,主要涉及5 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(圖4),分別包括TFAP2A、RUNX1、AG、AGL3 和arnt。在江漢雞群體中,發(fā)現(xiàn)7 個(gè)SNPs 位于調(diào)控元件的序列中(表1)。值得注意的是,TFAP2A 靶向的調(diào)控元件序列中分別包含2 個(gè)SNPs,且都位于正鏈上。

    表1 FSHβ 基因轉(zhuǎn)錄本內(nèi)有江漢雞遺傳變異位點(diǎn)的調(diào)控作用元件

    圖4 轉(zhuǎn)錄因子種類與數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    2.5 FSHβ 基因靶向miRNA 預(yù)測(cè)分析

    使用miRDB 在線軟件對(duì)FSHβ的mRNA(NM_204257.1)序列進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)miRNA 結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)置分?jǐn)?shù)在60 以上后獲取51 個(gè)miRNAs,這些miRNAs具有靶向轉(zhuǎn)錄本調(diào)控基因表達(dá)的潛力。通過對(duì)這51個(gè)miRNAs的種子序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)部分miRNA的種子序列中包含有江漢雞SNPs。其中g(shù)ga-miR-6605-5p的種子序列中包含多達(dá)3 個(gè)SNPs。將種子序列有SNPs的miRNAs 列出(表2),可用于江漢雞繁殖性狀中的調(diào)控作用研究。

    表2 種子序列中包含有江漢雞遺傳變異位點(diǎn)的miRNAs

    3 小結(jié)與討論

    隨著基因組重測(cè)序技術(shù)的普及,獲取地方雞基因組遺傳變異信息變得越來越容易。但是,如何在海量的遺傳變異位點(diǎn)中篩選出功能性變異依然具有很大的挑戰(zhàn)性。地方遺傳資源的開發(fā)與利用,歸根結(jié)底要利用功能性的遺傳變異進(jìn)行遺傳改良,而這也是應(yīng)用性研究的主要內(nèi)容。本研究關(guān)注繁殖激素FSH的β 亞基基因序列,利用基因組重測(cè)序技術(shù),獲取該基因序列在江漢雞群體中所有的遺傳變異位點(diǎn)。通過M6A 預(yù)測(cè)分析、調(diào)控元件預(yù)測(cè)分析和miRNA 結(jié)合序列分析,篩選出具有潛在功能性的遺傳變異位點(diǎn),用于今后的進(jìn)一步研究。

    FSHβ基因內(nèi)有豐富的遺傳變異位點(diǎn),且存在品種特性。王鵬等[7]在儋州雞FSHβ基因鑒定出25 個(gè)SNP 位點(diǎn),其中21 個(gè)SNPs 也存在于江漢雞群體中。通過比較發(fā)現(xiàn),兩個(gè)品種之間有部分SNPs 屬于品種特有,這些遺傳變異位點(diǎn)具有較高的研究?jī)r(jià)值。

    FSHβ基因富含遺傳多態(tài)位點(diǎn),有報(bào)道與產(chǎn)蛋性狀有關(guān)。在江漢雞+931 位置SNP,洪坤月等[8]發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與綠殼蛋雞開產(chǎn)日齡相關(guān)。在江漢雞+1024位置有SNP,田艷苓等[9]發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與濟(jì)寧百日雞開產(chǎn)日齡有關(guān)。李江曼[5]在+868 位置發(fā)現(xiàn)SNP 與寧都黃雞產(chǎn)蛋性能顯著相關(guān),但是江漢雞群體中沒有該變異。在江漢雞轉(zhuǎn)錄本3′utr 區(qū)+1299 位置為純合型,但在玫瑰冠雞和海蘭褐蛋雞中,秦玉梅等[6]發(fā)現(xiàn)該位置的堿基突變,且與300 日齡產(chǎn)蛋數(shù)有關(guān),該結(jié)果與孫杰等[10]的研究結(jié)果基本一致。王亞男[11]在FSHβ基因中發(fā)現(xiàn)了3 處SNPs 與京海黃雞體增重有關(guān),3 處變異位點(diǎn)對(duì)應(yīng)在轉(zhuǎn)錄本+606、+607 和+898位置,該位置與江漢雞變異情況一致,預(yù)測(cè)結(jié)果顯示+606、+607 位置位于TFAP2A 調(diào)控元件內(nèi),推測(cè)在體增重過程中其參與一定調(diào)控作用。韓厚明[12]在文昌雞FSHβ基因外顯子中發(fā)現(xiàn)3 處SNPs,其對(duì)應(yīng)在轉(zhuǎn)錄本+898、+931 和+1024 位置,與江漢雞變異情況一致。不過,文昌雞中上述3 個(gè)位點(diǎn)未見與產(chǎn)蛋性能關(guān)聯(lián)。

    總之,對(duì)江漢雞FSHβ基因進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)35 個(gè)SNPs 和2 個(gè)indels。值得注意的是,在這些變異位點(diǎn)之中,1 個(gè)SNP 位于cds 區(qū)造成甘氨酸變成絲氨酸。此外還發(fā)現(xiàn)7 個(gè)SNPs 位于潛在的調(diào)控元件序列中,7 個(gè)SNPs 和1 個(gè)indel 位于潛在的miRNA 結(jié)合序列中。所篩選的上述遺傳變異位點(diǎn),可能參與了FSHβ基因的表達(dá)調(diào)控,在江漢雞遺傳特性中扮演一定的角色。

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