不同臨床分期HIV-1感染者/AIDS患者血樣的蛋白印跡試驗帶型分析

郭　川，　紀琳瑩，　吳耀波，　林潔敏，　陳　婉

(汕頭市疾病預防控制中心衛(wèi)生檢驗科，廣東 汕頭 515041)

摘要：目的　分析各臨床分期的人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者/獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者血清中病毒蛋白抗體的變化，探討不同臨床分期的HIV-1感染者/AIDS患者蛋白印跡試驗(WB)的帶型特點。方法　對汕頭市2009至2012年確證的部分HIV-1抗體陽性病例進行CD4+T細胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結果對病例進行分組：原發(fā)感染期組(CD4+ ≥500/mm3)；感染中期組(CD4+ ≥ 200 /mm3且<500/mm3)； AIDS期組(CD4+ <200/mm3)；對各組的WB結果進行病毒蛋白(p17、p24、p31、p39、gp41、p51、p55、p66、gp120、gp160)抗體的陽性率統(tǒng)計以及帶型分析。結果　病毒蛋白p24、p31、gp41、p51、p66、gp120和gp160的抗體陽性率較高(總陽性率分別為98.2%、92.0%、90.8%、89.5%、93.3%、98.7%和97.5%)，且在3個分期組間未見明顯變化(P>0.05)；病毒蛋白p17、p39和p55呈現(xiàn)較低的抗體陽性率(總陽性率分別為68.9%、49.1%和42.5%)；蛋白p17的陽性率從原發(fā)感染期的91.5%降為感染中期的62.8%(P<0.01)及AIDS期59.3%(P<0.01)；WB結果中的全帶型、缺失p39+p55和缺失p17+p39+p55的帶型是3個疾病分期組患者的常見帶型；在3個分期組中，原發(fā)感染期中全帶型出現(xiàn)率最高(60.8%)，而缺失p17+p39+p55的出現(xiàn)率最低(6.5%)。結論　病毒蛋白p17抗體的陰轉可以作為疾病從原發(fā)感染期進入感染中期/AIDS期的一個潛在判別指標。

關鍵詞：帶型分析；蛋白印跡試驗；病毒抗體；陽性率；人類免疫缺陷病毒；臨床分期

中圖分類號：

不同臨床分期HIV-1感染者/AIDS患者血樣的蛋白印跡試驗帶型分析

郭川，紀琳瑩，吳耀波，林潔敏，陳婉

(汕頭市疾病預防控制中心衛(wèi)生檢驗科，廣東 汕頭 515041)

摘要：目的分析各臨床分期的人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者/獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者血清中病毒蛋白抗體的變化，探討不同臨床分期的HIV-1感染者/AIDS患者蛋白印跡試驗(WB)的帶型特點。方法對汕頭市2009至2012年確證的部分HIV-1抗體陽性病例進行CD4+T細胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結果對病例進行分組：原發(fā)感染期組(CD4+≥500/mm3)；感染中期組(CD4+≥ 200 /mm3且<500/mm3)； AIDS期組(CD4+<200/mm3)；對各組的WB結果進行病毒蛋白(p17、p24、p31、p39、gp41、p51、p55、p66、gp120、gp160)抗體的陽性率統(tǒng)計以及帶型分析。結果病毒蛋白p24、p31、gp41、p51、p66、gp120和gp160的抗體陽性率較高(總陽性率分別為98.2%、92.0%、90.8%、89.5%、93.3%、98.7%和97.5%)，且在3個分期組間未見明顯變化(P>0.05)；病毒蛋白p17、p39和p55呈現(xiàn)較低的抗體陽性率(總陽性率分別為68.9%、49.1%和42.5%)；蛋白p17的陽性率從原發(fā)感染期的91.5%降為感染中期的62.8%(P<0.01)及AIDS期59.3%(P<0.01)；WB結果中的全帶型、缺失p39+p55和缺失p17+p39+p55的帶型是3個疾病分期組患者的常見帶型；在3個分期組中，原發(fā)感染期中全帶型出現(xiàn)率最高(60.8%)，而缺失p17+p39+p55的出現(xiàn)率最低(6.5%)。結論病毒蛋白p17抗體的陰轉可以作為疾病從原發(fā)感染期進入感染中期/AIDS期的一個潛在判別指標。

關鍵詞：帶型分析；蛋白印跡試驗；病毒抗體；陽性率；人類免疫缺陷病毒；臨床分期

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)02-0145-04R446.61

文獻標志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.010

基金項目：汕頭市醫(yī)療科技計劃項目(汕府科[2013]88號)

作者簡介：郭川，男，1981年生，碩士，主管技師，主要從事病原微生物研究。

Abstract:ObjectiveTo analyze the change of anti-virus antibodies in serum of patients with different clinical stages of human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) infection/ acquired immune deficiency syndrome (AIDS), and to investigate the band pattern characteristics of Western blotting (WB). MethodsCD4+T cell counting was determined in the part of HIV-1 confirmed cases in Shantou from 2009 to 2012. According to the results, these cases were classified into 3 groups, primary-stage infection group (CD4+≥500 /mm3), middle-stage infection group (CD4+≥ 200/mm3and CD4+<500 /mm3) and AIDS group (CD4+<200 /mm3). The WB results of the 3 groups were analyzed and performed to determine the positive rates of antibodies against viral proteins (p17， p24， p31， p39， gp41， p51, p55， p66， gp120 and gp160) and the band patterns of WB. ResultsThe antibodies against viral protein p24， p31， gp41， p51， p66， gp120 and gp160 showed high total positive rates (98.2%, 92.0%, 90.8%, 89.5%, 93.3%, 98.7% and 97.5%, respectively) , while the positive rates had no obvious difference among the 3 stages (P>0.05). The antibodies against viral proteins p17, p39 and p55 showed low positive rates (68.9%, 49.1% and 42.5%, respectively). The positive rate of protein p17 showed an obvious declining between primary-stage infection groups (91.5%) and middle-stage infection group 62.8% (P<0.01)as well as AIDS group 59.3% (P<0.01). All bands, missing p39+p55 and missing p17+p39+p55 were the common band patterns of WB among the 3 groups. Primary-stage infection group showed the highest appearance rate (60.8%) of all bands but the lowest appearance rate (6.5%) of missing p17+p39+p55. ConclusionsTurning negative of antibody against viral protein p17 could be used as a potential distinguish parameter to forecast the disease progression of HIV-1 from primary-stage infection to middle-stage infection group/AIDS group.

收稿日期：( 2014-03-10)

The band patterns of Western blotting in different clinical stages of HIV-1 infection/AIDS patientsGUOChuan,JILinying,WUYaobo,LINJiemin,CHENWan.(DepartmentofHealthyLaboratory,CenterforDiseaseControlandPreventionofShantou,GuangdongShantou515041,China)

Key words: Band pattern; Western blotting; Viral antibody; Positive rate； Human immunodeficiency virus; Clinical stage

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired Immune deficiency syndrome，AIDS)是人類因為感染人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)后導致免疫缺陷，并發(fā)一系列機會性感染及腫瘤，嚴重者可導致死亡的綜合征。目前，AIDS已成為嚴重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。根據(jù)《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準》[1]，AIDS感染者隨疾病的進程可分為3期，分別是Ⅰ期(原發(fā)感染期)、Ⅱ期(感染中期)和Ⅲ期(AIDS期)。有報道稱隨著AIDS病程的發(fā)展，患者蛋白印跡試驗(Western blotting，WB)的結果會出現(xiàn)不同帶型特征[2]，從體液免疫的角度體現(xiàn)了HIV對機體免疫系統(tǒng)的破壞程度。因此，本研究通過對汕頭市HIV/AIDS進行臨床分期，分析各期WB結果中條帶的變化特征，探討不同疾病階段HIV/AIDS體內(nèi)血清學指標的變化規(guī)律。

材料和方法

一、研究對象

選擇汕頭市2009至2012年經(jīng)HIV感染確證試驗確定為HIV-1抗體陽性的病例；該部分病例須符合以下條件：(1)經(jīng)WB確證為HIV-1抗體陽性；(2)在確證為HIV-1抗體陽性后，進行了有效的CD4+T淋巴細胞計數(shù)試驗。

二、方法

1 .WB(HIV抗體確證試驗) 2009至2012年間對汕頭市自愿咨詢和常規(guī)監(jiān)測的疑似病例進行HIV感染確證試驗，采用AutoBlot System 20型全自動WB儀(美國MP公司產(chǎn)品)和HIV1+2型抗體檢測試劑盒[新加坡MP生物醫(yī)學有限公司產(chǎn)品，國食藥監(jiān)械(進)字2008第3403441號]進行試驗和判別。WB涉及的條帶為p17、p24、p31、p39、gp41、p51、p55、p66、gp120和gp160 10個病毒蛋白的相應抗體。若同時出現(xiàn)gp41、gp120和gp160中2種以上條帶，或出現(xiàn)gp41、gp120和gp160中任一條帶同時出現(xiàn)p24條帶，該病例判為HIV感染陽性病例；若10種病毒蛋白的抗體皆為陽性，則為全條帶帶型；非全條帶的帶型記錄其所缺失的條帶。

2 .CD4+T淋巴細胞計數(shù)和疾病分期 采用FACSCount型流式細胞儀(BD公司產(chǎn)品)和T淋巴細胞亞群計數(shù)試劑盒[BD公司產(chǎn)品，國食藥監(jiān)械(進)字2011第3403681號]對WB確證的部分HIV-1抗體陽性病例進行CD4+T細胞計數(shù)，參照文獻[1]中的分期方法及原則分為3組：原發(fā)感染期組(CD4+≥ 500 /mm3)；感染中期組(CD4+≥200 /mm3且< 500 /mm3)； AIDS期組(CD4+< 200 /mm3)。

3.各組中WB抗體條帶的陽性率統(tǒng)計及其帶型分析利用WB的結果對確證的HIV-1抗體陽性的部分病例進行病毒蛋白抗體攜帶情況分析，歸類統(tǒng)計各組中WB抗體條帶的陽性率；同時對各組中的WB抗體的帶型特點作大致分析。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析各組之間率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、CD4+T淋巴細胞計數(shù)

對368例陽性病例進行CD4+T細胞計數(shù)，結果見表1。

表1　各組CD4+T淋巴細胞數(shù)值

二、抗體總陽性率

研究共涉及2009至2012年確證的HIV-1抗體陽性病例368例，其中WB結果為出現(xiàn)全部特異性條帶者152例，占41.2%；所有研究樣本中，抗體特異性條帶出現(xiàn)的陽性率各有不同，陽性率最高的特異性條帶為p24、gp120及gp160，分別達98.2%、98.7%和98.5%；其次是p66、gp41、p31和p51，在90%左右； p17、p39和p55的陽性率較低，分別為68.9%、49.1%和42.5%。見表2。

三、各疾病分期病例HIV抗體特異性條帶的陽性率

各組的HIV抗體特異性條帶的出現(xiàn)情況見表2。在疾病3個分期組中特異性條帶p24、p31、gp41、p51、p66、gp120和gp160皆維持較高的抗體陽性率，且在3個分期組間未見明顯變化(P>0.05)，在3個疾病分期中p24、gp120和gp160抗體陽性率最高(接近100.0%)；陽性率變化較大的特異性條帶有p17，在原發(fā)感染期該蛋白抗體陽性率較高(91.5%)，但在感染中期和AIDS期中的陽性率發(fā)生較明顯的降低，分別為62.8%(P<0.01)和59.3%(P<0.01)；在3個分期中都呈現(xiàn)較低的病毒蛋白p39和p55抗體陽性率，在原發(fā)感染期和另外2個分期p39抗體差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而p55則在3個分期組間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2　WB中各個病毒蛋白的抗體陽性率　(%)

注：與感染中期組比較，*P<0.01；與AIDS期組比較，#P<0.01

四、 各疾病分期的WB帶型

有3種帶型在各個疾病分期中比較常見，其中全帶型為主要的優(yōu)勢帶型，說明大多數(shù)病例未缺失抗體條帶。特別是原發(fā)感染期全帶型的出現(xiàn)頻率為60.8%，感染中期和AIDS期各為35.6%和33.1%；原發(fā)感染期全帶型的出現(xiàn)頻率與其它2期相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；同時缺失p39和p55的帶型也占有較大比重，但缺失的帶型在各分期間的比重未見明顯差異(P>0.05)；同時缺失p17、p39和p55的帶型在感染中期和AIDS期占有較大比重，缺失率分別為24.7%和29.9%，但在原發(fā)感染期僅6.5%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。除上述3種帶型以外，其它各帶型所占的比例較少，只含有少數(shù)幾個病例。因此，即使有些帶型只出現(xiàn)在某個分期，也不能歸為該分期的特征帶型。見表3。

表3　各分期WB中的缺失帶型

注：與感染中期組比較，*P<0.01；與AIDS期比較，#P<0.01

討論

了解AIDS疾病進程的方法目前除了根據(jù)病例的臨床表現(xiàn)之外，還有病毒載量測定和CD4+T細胞計數(shù)。病毒載量是HIV在機體內(nèi)復制和增值水平的直接體現(xiàn)，其數(shù)值高低反應出病毒在機體內(nèi)活動的活躍程度；CD4+T淋巴細胞作為HIV的靶細胞，其數(shù)量的多少反應出機體免疫系統(tǒng)被病毒破壞的程度。它們是評估機體免疫系統(tǒng)，確定AIDS疾病分期的重要指標[1]，目前的研究中一般將其用于評估抗病毒治療的效果[3-5]。雖然HIV主要侵襲CD4+T淋巴細胞，但對免疫系統(tǒng)的破壞卻是綜合性的。因此，對免疫系統(tǒng)破壞性的評估，體液免疫也應該納入其中。而WB作為血清學檢測的手段，其結果不應單單只用于檢測是否感染HIV，還應從試驗中獲取機體內(nèi)病毒蛋白抗體的存在情況等信息，以用于綜合評價機體的免疫狀態(tài)。

機體感染HIV后，各種病毒蛋白的抗體陸續(xù)產(chǎn)生，因此隨著疾病的進程，不同疾病階段各病毒抗體組分在WB中的條帶反應強度各不相同。如有報道稱新發(fā)感染病例的WB條帶反應強度均低于長期感染者相應的條帶[6]，說明病毒抗體隨著病毒的感染增殖和機體免疫系統(tǒng)的反應有一個增長過程。一般來說，gp41、gp120、gp160分布在包膜上的蛋白在HIV感染后最早激發(fā)機體產(chǎn)生抗體。因此，gp41和gp160/gp120是HIV感染后的早期帶型。而在早期帶型出現(xiàn)3個月左右，WB的帶型趨于完全，此時很多的病毒蛋白抗體皆出現(xiàn)陽性[7]。本研究觀察到全部特異性抗體條帶陽性(全帶型)的病例占41.2%。這與鄧文青等[8]報道的40.61%結果基本一致。但本研究還觀察到在原發(fā)感染期，全帶型出現(xiàn)的頻率較高，為60.8%。但在進入感染中期和AIDS期后，全帶型的出現(xiàn)頻率分別降至35.6%和33.1%。該差異是不同臨床分期群體帶型差異的一個表現(xiàn)，說明隨著病毒的增殖及機體免疫系統(tǒng)的破壞，各種病毒蛋白的抗體條帶呈現(xiàn)一定程度的缺失。但因個體體質(zhì)的差異，缺失的程度不同，不宜作為個體上疾病進展的預判。gag基因編碼的p17、p39和p55蛋白抗體總陽性率較低(p55為42.5%、p39為49.1%、p17為68.9%)，與之前報道[8-9]的抗gag蛋白抗體除了p24為99.65%之外其它條帶檢出率都較低(p55為48.02%、p39為44.77%、p17為77.44%)的結果基本一致。但是也有報道稱p24抗體水平隨著AIDS疾病進展呈現(xiàn)下降的趨勢[7]，而本研究中觀察到p24抗體在3個分期中始終保持著高陽性率，原因有待于后續(xù)研究闡明。本研究發(fā)現(xiàn)p17蛋白雖然抗體總陽性率較低，但在原發(fā)感染期及后2個分期中呈現(xiàn)明顯的差異。處在原發(fā)感染期的大部分病例該蛋白的抗體為陽性(陽性率為91.5%)，而進入感染中期和AIDS期后，p17抗體陽性率明顯下降(陽性率分別為62.8%和59.3%)。在帶型分析中，全帶型、缺失p39+p55和缺失p17+p39+p55這3種帶型在3個疾病分期患者中都占有較大比重，但除了全帶型之外，原發(fā)感染期主要缺失p39+p55，AIDS期主要缺失p17+p39+p55，而感染中期則兩者基本占同等比重，從而也可以看出p17的缺失頻率在原發(fā)感染期到AIDS期的進程中呈現(xiàn)一種遞增的關系。因此，該蛋白抗體轉陰可以作為疾病從原發(fā)感染期進入感染中期或AIDS期的一個潛在判別依據(jù)。

其它病毒蛋白中，gp41、gp160和gp120在疾病的3個分期內(nèi)始終保持著較高的抗體陽性率。在類似的文獻報道中，此3種蛋白抗體在陽性病例中皆呈現(xiàn)接近100.0%的陽性率[8-9]。由于抗體水平在3個分期間的變化不顯著，對于疾病進程的判定來說參考意義不大。但其抗體水平為何未受機體免疫系統(tǒng)破壞的影響，以致在3個分期中都維持在高水平還有待后續(xù)研究闡明。

參考文獻

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準[S]. WS 293-2008，中華人民共和國衛(wèi)生部，2008.

[2]楊彩霞. HIV 感染者不同階段血清學, 免疫學指標變化及相關性研究[D]. 濟南：山東大學, 2008.

[3]MERMIN J, EKWARU JP, WERE W, et al. Utility of routine viral load, CD4 cell count, and clinical monitoring among adults with HIV receiving antiretroviral therapy in Uganda: randomised trial[J]. BMJ, 2011, 343: d6792.

[4]MUGAVERO MJ, AMICO KR, WESTFALL AO, et al. Early retention in HIV care and viral load suppression: implications for a test and treat approach to HIV prevention[J]. J Acquir Immune Defic Syndr, 2012, 59(1): 86-93.

[5]BOYER S, MARCH L, KOUANFACK C, et al. Monitoring of HIV viral load, CD4 cell count, and clinical assessment versus clinical monitoring alone for antiretroviral therapy in low-resource settings (Stratall ANRS 12110/ESTHER): a cost-effectiveness analysis[J]. Lancet Infect Dis, 2013, 13(7): 577-586.

[6]WANG JB, ZHANG N, YU HY, et al. Study on the role of western blot band profile for the detection of recent HIV infection[J]. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi, 2013, 34(10): 998-1002.

[7]李楠，繆禮鋒. WB帶型分析對HIV感染期和AIDS期的診斷意義[J].疾病控制雜志，2005，9(4)：376-377.

[8]鄧文青，吳湘云，代建平，等. 2 620份HIV-1抗體陽性標本蛋白印跡條帶分析[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學, 2012,39(21): 5638-5640.

[9]DURI K, MüLLER F, GUMBO FZ, et al. Human immunodeficiency virus (HIV) types Western blot (WB) band profiles as potential surrogate markers of HIV disease progression and predictors of vertical transmission in a cohort of infected but antiretroviral therapy na?ve pregnant women in Harare, Zimbabwe[J]. BMC Infect Dis, 2011, 11: 7.

(本文編輯：姜敏)