伽瑪?shù)墩丈鋵η嗝顾刂掳d癇貓腦組織中MDA水平、SOD活力的影響

董長征，孔艷莉，靳洪波，張素芳，鄭杰，梁傳棟，武江，岳向勇，李文玲(河北省人民醫(yī)院，石家莊05005;石家莊市第二醫(yī)院)

伽瑪?shù)墩丈鋵η嗝顾刂掳d癇貓腦組織中MDA水平、SOD活力的影響

董長征1，孔艷莉1，靳洪波2，張素芳1，鄭杰1，梁傳棟1，武江1，岳向勇1，李文玲1(1河北省人民醫(yī)院，石家莊050051;2石家莊市第二醫(yī)院)

摘要:目的探討伽瑪?shù)墩丈鋵η嗝顾刂掳d癇貓腦組織中丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響。方法選擇雄性成年貓30只，隨機分為正常對照組、癲癇模型組和伽瑪?shù)吨委?、8、12周組各6只。除正常對照組外，其余組通過向貓右額葉皮質注射青霉素制作癲癇模型，伽瑪?shù)吨委?、8、12周組在造模成功后給予低劑量伽瑪?shù)墩丈?。采用Racine分級標準進行行為學觀察。4周后正常對照組、癲癇模型組和伽瑪?shù)吨委?周組均將貓?zhí)幩?，伽瑪?shù)吨委?、12周組于治療8、12周后分別將貓?zhí)幩?，處死后均立即取出貓右額葉腦組織，采用硫代巴比妥酸比色法檢測腦組織中MDA水平，WST-1法檢測SOD活力。結果癲癇模型組貓發(fā)作級別多達到Ⅳ～Ⅵ級;伽瑪?shù)吨委?、8周組貓癲癇發(fā)作級別和持續(xù)時間與癲癇模型組比較無統(tǒng)計學變化;伽瑪?shù)吨委?2周組癲癇發(fā)作級別降低，多為Ⅰ～Ⅱ級。與正常對照組比較，癲癇模型組腦組織中MDA水平升高，SOD活力降低(P均＜0.05);與癲癇模型組比較，伽瑪?shù)吨委?周和8周組MDA水平及SOD活力無統(tǒng)計學變化，而伽瑪?shù)吨委?2周組MDA水平減低(P＜0.05)，SOD活力升高(P＜0.05)。結論伽瑪?shù)墩丈渲委熌芙档颓嗝顾刂掳d癇貓腦組織中MDA水平，提高SOD活力，減輕實驗貓癲癇發(fā)作后的氧化應激損傷。

關鍵詞:癲癇;伽瑪?shù)?氧化應激;丙二醛;超氧化物歧化酶

自由基與癲癇的發(fā)生、發(fā)展關系密切［1］。研究［2］發(fā)現(xiàn)，腦內脂質過氧化物顯著增加、氧自由基清除劑相對減少是癲癇發(fā)生、發(fā)展的重要原因。伽瑪?shù)墩丈鋵Σ糠蛛y治性癲癇的治療取得一定療效，為進一步研究其抗癲癇的作用機制，我們選用青霉素致癲癇貓模型，觀察伽瑪?shù)墩丈鋵η嗝顾刂掳d癇貓腦組織丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響，探討伽瑪?shù)墩丈涫欠駥Πd癇發(fā)作后腦損傷具有神經保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性成年貓30只，體質量2.5～3.5 kg，河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2試劑及儀器注射用青霉素(華北制藥股份有限公司，批號13020655);異丙酚(200mg/支，北京費森尤斯公司);伽瑪?shù)?LEKSELL C型，瑞典ELEKTA公司);磁共振儀(美國GE公司); SOD、MDA試劑盒購自南京市建成生物工程研究所。

1.3動物分組、造模及干預將30只貓按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、癲癇模型組和伽瑪?shù)吨委?、8、12周組，每組各6只。正常對照組不做任何處理;癲癇模型組和伽瑪?shù)吨委熃M在貓額葉皮質多次注射青霉素制作癲癇模型，異丙酚靜脈麻醉，貓右額頭皮做直切口，長約3 cm，暴露貓右額葉皮層組織，用MS4000U-1生物信號定量記錄分析系統(tǒng)刺激器刺激腦皮質，引起對側后肢收縮的區(qū)域定為運動皮質。用微量注射器抽取青霉素1萬U，以60°角斜刺入動物右額皮質的無血管區(qū)，縫合頭皮。青霉素每間隔3d注射1次，共注射7次。伽瑪?shù)吨委熃M在造模成功后給予伽瑪?shù)墩丈洌?%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉實驗用貓，將其頭部安裝于Leksell立體定向頭架，用磁共振儀進行無間隔定位掃描，層厚2mm。

掃描圖像經計算機網(wǎng)絡傳至Gamma Plan系統(tǒng)制定治療計劃，確定照射靶區(qū)位于右側額葉的X、Y、Z坐標。然后將固定貓腦的Leksell框架按所定坐標安放于伽瑪?shù)抖ㄎ患苌?，?mm準直器，對靶區(qū)腦組織實施照射，邊緣劑量15 Gy，等劑量曲線50%。

1.4行為學觀察參照Racine分級標準觀察各組貓的癲癇發(fā)作行為。0級:無反應或抽搐停止;Ⅰ

級:節(jié)律性口角或面部抽動;Ⅱ級:點頭或甩尾;Ⅲ級:單肢抽動;Ⅳ級:多肢抽動或強直;Ⅴ級:全面性強直陣攣發(fā)作。視頻監(jiān)控下觀察實驗貓的發(fā)作級別和持續(xù)時間。

1.5腦組織中MDA水平、SOD活力測定4周后正常對照組、癲癇模型組和伽瑪?shù)吨委?周組均將貓?zhí)幩?，伽瑪?shù)吨委?、12組于治療8、12周后分別將貓?zhí)幩?，立即取出右額葉腦組織稱重，用生理鹽水作勻漿介質，充分勻漿，離心，取上清液放入－70℃冰箱保存待用。嚴格按照試劑盒說明書進行分步操作，分別采用硫代巴比妥酸比色法檢測腦組織中MDA水平，WST-1法檢測SOD活力。

1.6統(tǒng)計學方法采用SAS8.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1行為學變化正常對照組無癲癇發(fā)作。癲癇模型組均有癇性發(fā)作，為間斷性，發(fā)作級別達Ⅳ～Ⅵ級，全身強直陣攣發(fā)作多見，每次發(fā)作持續(xù)3～5min。伽瑪?shù)吨委?、8周組癲癇發(fā)作級別和持續(xù)時間與癲癇模型組比較差異無統(tǒng)計學意義;伽瑪?shù)吨委?2周組癲癇發(fā)作級別減低，多為Ⅰ～Ⅱ級，表現(xiàn)為貓的面部抽搐或點頭動作，發(fā)作時間為1～3min。

2.2各組貓腦組織中MDA水平、SOD活力比較伽瑪?shù)吨委熀?，隨著時間延長，MDA水平有減低趨勢，SOD活力有上升趨勢，伽瑪?shù)吨委?2周組MDA水平明顯降低，SOD活力明顯升高，與癲癇模型組比較，P均＜0.05，見表1。

表1　各組貓腦組織中MDA水平及SOD活力比較()

表1　各組貓腦組織中MDA水平及SOD活力比較()

注:與正常對照組比較，▲P＜0.05;與癲癇模型組比較，△P＜0.05。

組別　nmDA(nmol/mg蛋白)SOD(U/mg蛋白)正常對照組6　10.37±1.52　200.63±11.33癲癇模型組　6　31.65±1.47▲　130.72±12.24▲伽瑪?shù)吨委?周組　6　29.54±1.17　138.27±5.37伽瑪?shù)吨委?周組　6　25.04±2.36　145.38±8.27伽瑪?shù)吨委?2周組　6　19.16±2.01△　173.68±11.41△

3　討論

自由基過量產生引起的氧化應激損傷參與了癲癇的發(fā)生和發(fā)展過程［3，4］。正常生理情況下，腦組織內氧化與抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當機體發(fā)生癲癇時，腦組織氧代謝障礙產生大量氧自由基，氧自由基可使神經細胞膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應，且通過脂氫過氧化物的分解產物引起神經細胞損傷，導致神經細胞的內質網(wǎng)、線粒體、溶酶體等結構破壞，細胞膜對離子通透性的改變［5］，與此同時，機體內抗氧化酶類活性減低，清除氧自由基的能力下降，腦內氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡失調，活性氧增加，從而導致腦組織氧化應激反應，造成神經細胞過氧化損傷，神經細胞興奮性增加，癲癇發(fā)作進一步加重，使氧自由基平衡系統(tǒng)進一步被破壞，氧自由基繼續(xù)增多，神經細胞的損傷繼續(xù)加重，形成惡性循環(huán)。

MDA是體內生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應的中間產物，其對機體的損害作用主要使不飽和脂肪酸過氧化，進而造成細胞膜的持續(xù)損害，因此其含量反映了腦內脂質過氧化程度，間接反映了氧自由基對神經細胞損傷的程度［6］。

SOD是機體內防御生命活動中氧自由基破壞損傷的抗氧化酶，為機體直接清除自由基的重要酶類，其主要功能是將氧的單價還原物超氧陰離子自由基歧化成H2O2和O2，能減輕缺血缺氧導致的神經元損傷，阻斷氧自由基對機體的進一步損傷。其活力高低間接反映了機體清除氧自由基的能力［7］。

青霉素是腦內抑制性神經遞質GABA的A受體拮抗劑，常被用來建立實驗動物的癲癇模型。前期研究中，我們應用青霉素反復多次腦額葉皮質注射成功建立了貓的慢性癲癇模型，適于伽瑪?shù)吨委煱d癇的模型研究［8］。本研究結果顯示，低劑量伽瑪?shù)墩丈?2周后抑制了青霉素誘導貓的癲癇發(fā)作，對控制和預防癲癇的發(fā)作有一定作用，與我們既往結果大致相同。本研究結果還顯示，與正常對照組比較，癲癇模型組MDA水平升高，而SOD活力較正常對照組明顯降低，說明癲癇反復發(fā)作后腦組織內氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡被打亂，產生過量的氧自由基，SOD過量耗損而明顯減少，導致神經細胞氧化損傷，興奮性增高，異常放電增加，癲癇發(fā)作進一步發(fā)展。蔡紅衛(wèi)等［9］研究認為大鼠腹腔注射戊四氮誘發(fā)抽搐發(fā)作后大鼠海馬組織中MDA水平明顯升高，SOD含量明顯減少。劉鳳英等［10］研究表明，成人癲癇存在SOD的代謝紊亂，下降的SOD可能通過損傷線粒體，增加腦內興奮性神經遞質的合成，促進神經元凋亡，進而參與成人癲癇的病理生理過程。以上研究與本研究結果相一致。與癲癇模型組比較，伽瑪?shù)墩丈?2周組中MDA水平明顯降低，SOD活力明顯升高，貓的癲癇發(fā)作級別減低;伽瑪?shù)墩丈?、8周組MDA水平和SOD活力雖有變化，但變化不明顯，無統(tǒng)計學意義，說明伽瑪?shù)墩丈渲委煱d癇需一定時間后才能顯現(xiàn)效果;伽瑪?shù)墩丈淇山档桶d癇腦組織中MDA水平，提高SOD活力，從而降低腦內氧自由基含量，重建氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡，進而

實現(xiàn)神經保護作用，抑制貓的癲癇發(fā)作。

總之，伽瑪?shù)吨委煱d癇的機制尚不十分清楚，可能與伽瑪?shù)墩丈浣档椭掳B灶內谷氨酸的水平［11］、抑制神經元的凋亡及相關凋亡基因的表達［12］等有關。本研究提示，抑制氧自由基引起的脂質過氧化反應，增加自由基的清除可能參與了伽瑪?shù)吨委煱d癇的生理機制，為進一步伽瑪?shù)吨委煱d癇提供了充分的實驗依據(jù)。

參考文獻:

［1］王飛鳳，溫玉梅，孫俊巖，等.尼莫地平輔助治療難治性癲癇對血自由基水平的影響［J］.貴陽醫(yī)學院學報，2013，38(2): 171-172.

［2］Rowley S，Patelm.Mitochondrial involvement and oxidative stress in temporal lobe epilepsy［J］.Free Radic Biolmed，2013，62(9): 121-131.

［3］孫錫波，韓玉香，韓濤，等.二氮嗪對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元超微結構及自由基的影響［J］.山東大學學報(醫(yī)學版)，2011，49(2): 19-23.

［4］段曉秋，王浩.癲癇過程中腦組織自由基的變化與細胞損傷關系的研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2012，21(18): 1961-1962.

［5］Shin EJ，Jeong JH，Chung YH，et al.Role of oxidative stress in epileptic seizures［J］.Neurochem Int，2011，59(2): 122-137.

［6］Bajpai A，Verma AK，Srivastavam，et al.Oxidative stress andmajordepression［J］.J Clindiagn Res，2014，8(12): 4-7.

［7］張笑天，鄭曉瑛.氧化自由基清除劑超氧化物歧化酶與疾病［J］.中國公共衛(wèi)生，2014，30(10): 1349-1352.

［8］董長征，李文玲，董秀芳，等.適合伽瑪?shù)墩丈涞呢埞δ軈^(qū)慢性點燃癲癇模型制作及其致癇機制［J］.中國老年學雜志，2013，33(20): 5063-5065.

［9］蔡紅衛(wèi)，馮娟娟.三氟拉嗪對癲癇大鼠NO、NOS、SOD、MDA的影響［J］.世界中西醫(yī)結合雜志，2010，5(7): 585-587.

［10］劉鳳英，蔡學坤，張琪，等.成人癲癇患者血清超氧化物歧化酶的水平變化及意義［J］.山東醫(yī)藥，2013，53(12): 12-14.

［11］董長征，岳向勇，趙文清，等.低劑量伽瑪?shù)墩丈鋵δ軈^(qū)癲癇貓模型的治療作用及機制研究［J］.中國全科醫(yī)學，2011，14(4B): 1219-1221.

［12］董長征，李文玲，趙文清，等.低劑量伽瑪?shù)墩丈渲委煂δ軈^(qū)癲癇動物行為及其皮層神經元顯微結構的影響［J］.山東醫(yī)藥，2011，51(2): 24-25.

收稿日期:( 2015-04-08)

基金項目:河北省衛(wèi)生廳指令性計劃項目(20120009)。

文章編號:1002-266X(2015)33-0025-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R742.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.008