大黃酚對(duì)青光眼神經(jīng)退行性病變的保護(hù)作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

胡　浩，江靈莉

作者單位：(317500)中國(guó)浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院眼科

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·實(shí)驗(yàn)研究·

大黃酚對(duì)青光眼神經(jīng)退行性病變的保護(hù)作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

胡浩，江靈莉

作者單位：(317500)中國(guó)浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院眼科

Citation:Hu H, Jiang LL. Protective effect of chrysophanol on neural degeneration caused by glaucoma and its mechanism.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(1):34-36

摘要

目的：探討大黃酚對(duì)慢性青光眼大鼠的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

方法：采用雙極電凝器電凝鞏膜表面3組靜脈，建立慢性高眼壓大鼠模型，分為3組。一組為高眼壓模型組，一組為大黃酚低劑量組(25mg/kg)，一組為大黃酚高劑量組(50mg/kg)，每組各15只，右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼為正常對(duì)照眼。連續(xù)給藥6wk后處死大鼠并摘取眼球，PCR和Western-blot檢測(cè)PERK和ROCK-1在視網(wǎng)膜中的表達(dá)。

結(jié)果：大黃酚高、低劑量組能有效降低大鼠眼內(nèi)壓，與模型眼相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。正常對(duì)照視網(wǎng)膜p-PERK蛋白水平表達(dá)比較低，青光眼模型組表達(dá)顯著升高，高、低劑量大黃酚使其表達(dá)增高。ROCK-1在視網(wǎng)膜中的表達(dá)在青光眼模型組表達(dá)最高，各治療組均可使其表達(dá)下降，以高劑量組下降最顯著。RT-PCR結(jié)果表明，高劑量組大鼠視網(wǎng)膜PERK mRNA水平明顯高于模型對(duì)照眼；ROCK-1 mRNA水平則顯著降低。

結(jié)論：高劑量大黃酚能有效降低青光眼大鼠的眼內(nèi)壓，其作用機(jī)制可能是通過(guò)激活PERK蛋白磷酸化以調(diào)控PERK/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮其保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：大黃酚；青光眼；PERK；ROCK；神經(jīng)保護(hù)

引用：胡浩，江靈莉.大黃酚對(duì)青光眼神經(jīng)退行性病變的保護(hù)作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.國(guó)際眼科雜志2016;16(1):34-36

0引言

青光眼是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性眼部疾病，它是全球第二大致盲性眼病。青光眼的神經(jīng)性病變發(fā)生在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及視神經(jīng)軸突，高眼壓是其病變的主要原因之一[1]。眼內(nèi)壓的升高引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其軸突漸進(jìn)性及不可逆轉(zhuǎn)的損失，導(dǎo)致視力喪失。大黃酚是中藥大黃主要的有效單體之一，屬于蒽醌類化合物。研究表明，大黃酚在腦缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病中表現(xiàn)出很好的神經(jīng)保護(hù)作用[2]。為此，本研究通過(guò)考察慢性高眼壓大鼠在大黃酚治療后眼內(nèi)壓的變化，初步探討大黃酚對(duì)青光眼治療的可能機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料PERK和p-PERK多克隆抗體，ROCK-1多克隆抗體(美國(guó)Santa公司)，Tono-pen XL筆式眼壓計(jì)(美國(guó)Mentor)，手術(shù)顯微鏡(上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠)。SPF級(jí)SD雄性大鼠(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)45只，體質(zhì)量160～180g，無(wú)眼疾。隨機(jī)分為3組，一組為高眼壓模型組，一組為大黃酚低劑量組(25mg/kg)，一組為大黃酚高劑量組(50mg/kg)，每組各15只，右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼為正常對(duì)照眼。

1.2方法大鼠3%戊巴比妥鈉溶液按30mg/kg行腹腔注射麻醉，鹽酸奧布卡因進(jìn)行眼表面麻醉，抗生素注射液滴眼，剪開(kāi)右眼外眥部，上下眼瞼縫線開(kāi)瞼，分別于3∶00、6∶00、9∶00及12∶00位處，沿角鞏膜緣剪開(kāi)球結(jié)膜和其下方的Tenon囊，切口長(zhǎng)約2mm，沿切口的兩端行放射狀切開(kāi)，在直肌旁側(cè)或其下方找到3條鞏膜表層靜脈，用燒灼器迅速輕點(diǎn)燒灼，阻斷成功的標(biāo)志是血管立即收縮，其遠(yuǎn)端血流中斷。術(shù)后結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn) 3g/L諾氟沙星滴眼液。假手術(shù)對(duì)照眼只剪開(kāi)外眥部不燒灼。術(shù)前、術(shù)后即刻及術(shù)后每周用Tono-Pen XL眼壓計(jì)測(cè)眼壓。建模第3d起高眼壓大黃酚治療組每天灌胃給藥(大黃酚25mg/kg或50mg/kg)，高眼壓模型組每天灌胃等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。到6wk末，用100g/L水合氯醛溶液按3mL/kg的劑量腹腔麻醉，隨后摘取每只鼠的雙眼，去除其眼球前節(jié)。在無(wú)菌條件于顯微鏡下將眼球做成眼杯，小心剝離出視網(wǎng)膜組織，液氮下冷凍，-80℃儲(chǔ)存。

1.2.1 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中基因表達(dá)采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織中PERK 和 ROCK-1的mRNA表達(dá)。首先使用Trizol試劑盒從視網(wǎng)膜組織中提取總mRNA，然后將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 3min，循環(huán)體：95℃ 30s， 55℃ 30s，72℃ 30s，35～40個(gè)循環(huán)，延伸：72℃ 15min。GAPDH引物序列：上游5’-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3’，下游 5’-TGTCATTGAGAGCAATGCCAGC-3’；PERK引物序列：上游5’-AAGATGGTACAGTGGACGGC-3’，下游5’-CCGTGTTCCTGGTGAAATCT-3’;ROCK-1引物序列：上游5’-CCCTCACCACTTTCCAGCCA-3’，下游5’-GGCGGTGGCTTAAAAACATGC-3’。以PERK mRNA、ROCK-1 mRNA與GAPDH mRNA含量比值作為PERK mRNA、ROCK-1 mRNA表達(dá)水平。

1.2.2 Western-blot檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中蛋白表達(dá)取各樣本蛋白質(zhì)50μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2h，TBST液洗膜3次，每次5min，共3次，加入相對(duì)應(yīng)的特異性一抗孵育，ROCK-1多克隆抗體的工作濃度為1∶500，PERK和p-PERK多克隆抗體的工作濃度都為1∶1000。4℃孵育過(guò)夜。TBST液洗膜3次，每次5min，然后二抗室溫孵育2h，TBST液洗膜3次，每次5min，共3次，ECL曝光后采用Quantity-one Software 4.6.9測(cè)定各條帶光密度。

2結(jié)果

2.1高眼壓大鼠模型的眼壓觀察大鼠術(shù)前右眼和左眼眼壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(15.87±1.87vs16.02±2.02mmHg，t=0.5233，P=0.6031)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組眼壓在14～17mmHg范圍波動(dòng)。高眼壓模型眼(右眼)眼壓相對(duì)于對(duì)照眼明顯升高(16.42±2.18vs21.81±2.92mmHg，t=6.770，P=0.0045)。在連續(xù)給藥6wk后，大黃酚高、低劑量組大鼠眼內(nèi)壓平均下降了31%和22%(圖1)。

圖1各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)眼內(nèi)壓變化情況Sham：假手術(shù)組；Model：模型組；25mg/kg：25mg/kg大黃酚灌胃組；50mg/kg：50mg/kg大黃酚灌胃組;bP<0.01，dP<0.001vsSham組；aP<0.05，fP<0.01vsModel組。

圖2大鼠視網(wǎng)膜中mRNA表達(dá)水平A：各組大鼠視網(wǎng)膜ROCK-1信使RNA表達(dá)水平；B：各組大鼠視網(wǎng)膜PERK信使RNA表達(dá)水平；Sham：假手術(shù)組；Model：模型組；25mg/kg：25mg/kg大黃酚灌胃組；50mg/kg：50mg/kg大黃酚灌胃組。aP<0.05，bP<0.01vsSham組；cP<0.05，dP<0.01vsModel組。

2.2各組大鼠視網(wǎng)膜中PERK和ROCK基因的表達(dá)量以PERK/GAPDH和ROCK/GAPDH比值代表PERK和ROCK mRNA的相對(duì)表達(dá)情況。由圖2可見(jiàn)，高眼壓模型大鼠視網(wǎng)膜ROCK-1和PERK mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照眼視網(wǎng)膜水平顯著升高(t=0.0008，P=0.0008；t=4.415，P=0.0116)。大鼠大黃酚灌胃6wk后，在低劑量組和高劑量大鼠視網(wǎng)膜PERK mRNA與高眼壓模型對(duì)照組相比都上升(t=3.388，P=0.0276；t=6.944，P=0.0023)。而ROCK-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較高眼壓視網(wǎng)膜相比都顯著下降(t= 3.034，P=0.0383；t=5.162，P=0.0067)。

圖3大鼠視網(wǎng)膜蛋白表達(dá)水平A：各組大鼠視網(wǎng)膜ROCK-1、PERK、p-PERK蛋白表達(dá)條帶；B：各組大鼠視網(wǎng)膜ROCK-1蛋白表達(dá)水平；C：各組大鼠視網(wǎng)膜PERK蛋白表達(dá)水平；D：各組大鼠視網(wǎng)膜p-PERK蛋白表達(dá)水平；Sham：假手術(shù)組；Model：模型組；25mg/kg：25mg/kg大黃酚灌胃組；50mg/kg：50mg/kg大黃酚灌胃組。aP<0.05，bP<0.01vsSham組；cP<0.05，dP<0.01vsModel組。

2.3視網(wǎng)膜中PERK/ROCK信號(hào)通路作用抑制為了探討大黃酚對(duì)高眼壓大鼠治療的作用機(jī)制，采用Western-blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜中p-PERK、PERK和ROCK-1的蛋白水平(圖3)。結(jié)果表明，相對(duì)于正常對(duì)照眼視網(wǎng)膜，高眼壓模型組中p-PERK蛋白表達(dá)水平顯著增加(t=2.951，P=0.0419)， 并且PERK蛋白表達(dá)也增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.624，P=0.2029)。同時(shí)，ROCK-1蛋白表達(dá)也大大上升(t=7.167，P=0.0056)。在給藥6wk后，與高眼壓模型相比，高低劑量組大鼠視網(wǎng)膜p-PERK蛋白(t=4.935，P=0.0078；t=1.025，P=0.413)和PERK蛋白(t=5.171，P=0.0066；t=2.106，P=0.103)都呈上升趨勢(shì)，而ROCK-1蛋白表達(dá)卻下降(t=5.971，P=0.004；t=4.603，P=0.012)。

3討論

青光眼是具有病理性高眼壓合并視盤(pán)、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層損害及青光眼視野改變的一種致盲性眼病，而高眼壓是其病變的主要原因，其特征表現(xiàn)為視神經(jīng)萎縮和視野缺損。視神經(jīng)損傷是青光眼發(fā)病的一個(gè)重要因素，而視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡是青光眼神經(jīng)病變的最終通路[3]。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase，PERK)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的一個(gè)重要途徑，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)三大通路之一[4]。細(xì)胞凋亡促成青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的丟失，而青光眼視網(wǎng)膜損傷的主要病理變化之一就是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的減少。Rho相關(guān)蛋白激酶(Rho associated kinase，ROCK)的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的重組，從而廣泛參與神經(jīng)再生、細(xì)胞凋亡等一系列神經(jīng)保護(hù)作用。最近，研究表明ROCK抑制劑能引起眼壓下降和房水外流增加，在保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、降低眼內(nèi)壓以及改善眼部血流量等方面為青光眼的治療提供了一個(gè)新的良好前景，并且其對(duì)于青光眼濾過(guò)性手術(shù)后瘢痕的形成也有減輕效果[5]。

大黃酚是從廖科植物大黃中提取的主要有效成分之一，研究表明大黃酚具有止咳、抗菌、止血作用，并能促進(jìn)腸管動(dòng)物的神經(jīng)興奮和肌肉麻痹。它對(duì)于腦缺血再灌注小鼠腦中過(guò)氧化氫酶活性有增強(qiáng)作用，其具有明顯的抗衰老作用[6]。對(duì)于衰老小鼠的記憶障礙，大黃酚能增加腦組織超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，改善被動(dòng)回避性記憶障礙[7]。近年來(lái)，大黃酚對(duì)于神經(jīng)保護(hù)作用的研究越來(lái)越多。為此，本研究首次嘗試探討大黃酚對(duì)于視網(wǎng)膜的神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究通過(guò)構(gòu)建經(jīng)典的慢性眼壓大鼠模型，通過(guò)測(cè)定眼內(nèi)壓來(lái)判斷高眼壓大鼠模型的構(gòu)建情況。大鼠青光眼模型構(gòu)建成功后，我們進(jìn)一步考察了大黃酚對(duì)青光眼大鼠的保護(hù)作用，并探討了大黃酚對(duì)青光眼保護(hù)的可能分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高眼壓大鼠在大黃酚灌胃給藥6wk后，眼內(nèi)壓明顯降低，提示其對(duì)于青光眼有一定的治療效果。大鼠視網(wǎng)膜PERK蛋白磷酸化比例顯著升高，相同的，ROCK-1蛋白的表達(dá)在高眼壓大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)也明顯增加，提示PERK蛋白磷酸化以及ROCK蛋白在青光眼的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。同時(shí)，mRNA結(jié)果也顯示出相同的趨勢(shì)，PERK和ROCK-1兩者的mRNA表達(dá)水平在模型大鼠視網(wǎng)膜中也顯著上升。由此我們可以推測(cè)，大黃酚可通過(guò)降低眼內(nèi)壓治療青光眼，其機(jī)制之一可能是通過(guò)調(diào)控PERK/ROCK信號(hào)通路。最近，研究還表明青光眼引起的視神經(jīng)萎縮，在眼壓得到控制后仍有神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡、視功能的損害，說(shuō)明高眼壓不是視功能損害的唯一原因。視神經(jīng)的血液供應(yīng)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的補(bǔ)充也是影響青光眼治療的重要原因。王樹(shù)等[8]發(fā)現(xiàn)大黃酚對(duì)于腦缺血再灌注小鼠有一定的保護(hù)作用，它能提高大鼠腦內(nèi)的血流量。由于視神經(jīng)的血液供應(yīng)與大腦血管都來(lái)自頸內(nèi)動(dòng)脈，大黃酚或許也能通過(guò)改善大鼠大腦血液供應(yīng)從而增加視神經(jīng)的血液供應(yīng)來(lái)發(fā)揮其治療青光眼的作用。除此之外，宋金艷等證實(shí)了大黃酚脂質(zhì)體能提高腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達(dá)，而B(niǎo)DNF保護(hù)視神經(jīng)功能作用在體內(nèi)、體外青光眼模型得到許多證實(shí)[9]。關(guān)于大黃酚對(duì)青光眼大鼠保護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)制有待深入探討。

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Protective effect of chrysophanol on neural degeneration caused by glaucoma and its mechanism

Hao Hu, Ling-Li Jiang

Department of Ophthalmology, the First People’s Hospital of Wenling, Wenling 317500, Zhejiang Province, China

Correspondence to:Hao Hu. Department of Ophthalmology, the First People’s Hospital of Wenling, Wenling 317500, Zhejiang Province, China. huhao06@126.com

Received：2015-08-19Accepted：2015-12-14

Abstract

?AIM:To investigate the effect and mechanism of chrysophanol for rat model with glaucoma.

?METHODS:The glaucoma rat models were made by cauterization of three episcleral veins. Then the glaucoma rats were divided into three groups. Group 1 was the untreated intraocular hypertension group. Group 2 was the low dose of chrysophanol group (25mg/kg). Group 3 was the high dose of chrysophanol group (50mg/kg), 15 rats in each group. The right eyes were the experiment eyes while the left were the control ones. After 6wk treatment, the mRNA and protein of protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) and Rho kinase 1 (ROCK-1) were determined in the retina.

?RESULTS:The chrysophanol reduced intraocular pressure (IOP) of experiment eyes, which was significantly lower than that of control eyes (P<0.01). Compared with the normal group, the p-PERK protein increased significantly in the retina of glaucoma model group and chrysophanol increased the lever of p-PERK protein. The ROCK-1 protein level increased significantly in glaucoma group, it all decreased in these treatment groups, and it decreased significantly in high dose treatment group. Detected by TR-PCR, chrysophanol also could activate the mRNA of PERK and inhibited the mRNA expression of ROCK-1 in a rat model of glaucoma.

?CONCLUSION:These results suggest that chrysophanol can reduce the IOP through the phosphorylation of PERK protein to regulate the PERK/ROCK signaling in glaucoma rat model.

KEYWORDS:?chrysophanol;glaucoma;protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase;Rho kinase 1;neuroprotection

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.1.08

收稿日期：2015-08-19 修回日期： 2015-12-14

通訊作者：胡浩.huhao06@126.com

作者簡(jiǎn)介：胡浩，畢業(yè)于溫州醫(yī)科大學(xué)，副主任醫(yī)師，研究方向：白內(nèi)障、青光眼、眼視光學(xué)。