齊墩果酸對小鼠急性肝臟氧化損傷治療作用研究

郗艷麗，鄭曉娟，魏振奇，劉　敏，葛紅娟，宋春梅

(吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院，吉林 吉林　132013)

·論著·

齊墩果酸對小鼠急性肝臟氧化損傷治療作用研究

郗艷麗，鄭曉娟，魏振奇，劉敏，葛紅娟，宋春梅*

(吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院，吉林 吉林132013)

摘要：目的建立肝臟急性氧化損傷模型，觀察齊墩果酸對小鼠肝臟氧化損傷的治療作用。方法3 mL/kg四氯化碳(CCl4)腹腔注射，24 h后給予齊墩果酸灌胃，干預2 d后處死小鼠。檢測肝臟臟器系數(shù)、病理改變、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。結果齊墩果酸未拮抗CCl4引起的SOD含量降低以及MDA含量升高(P>0.05)，也未能減輕小鼠肝組織的損傷程度。結論CCl4誘導小鼠急性肝臟氧化損傷以后，再給予齊墩果酸治療，效果不佳。

關鍵詞：齊墩果酸；氧化損傷；治療作用

文章編號：1673-2995(2015)02-0081-03

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：識碼： A

Abstract:ObjectiveTo establish an acute liver oxidative damage model and investigate the therapeutical effects of oleanolic acid on mouse modell. MethodsThe mice were injected with carbon tetrachloride at the dose of 3 mL/kg.After 24 hours,they were gavagedwith oleanolic acid once every day. After Two days,the mice were sacrificed to measure their liver indexes,pathological changes,superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content in liver. ResultsOleanolic acid treatment exhibited no significant inhibition effect on the decrease in SOD activity and increase in MDA content(P>0.05),and failed to reduce the extent of damage in liver. ConclusionIt is anineffective treatment with oleanolic acid for CCl4-induced acute liver oxidative damage in mice.

基金項目：吉林省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目.

作者簡介：郗艷麗(1981-)，女(漢族)，講師,博士.

通訊作者：宋春梅(1964-)，女(漢族)，教授，碩士.

收稿日期：( 2014-11-04)

Therapeutical effects of oleanolic acid on acute liver oxidative damage in mice

XI Yanli,ZHENG Xiaojuan,WEI Zhenqi,LIU Min,GE Hongjuan,SONG Chunmei*(School of Public Health,Jilin Medical College,Jilin City，Jilin Province,132013，China)

Key words: oeanolic acid;oxidative damage;terapeutical effects

急性肝損傷是各種原因引起的肝功能異常，嚴重的肝損傷會導致肝功能衰竭。引起肝急性損傷的原因很多，主要有用藥不當、食品添加劑使用不當、乙醇攝入過多、病毒感染等。氧化應激是誘發(fā)肝損傷的主要原因之一。有效的預防和治療氧化損傷的藥物，可以避免患者發(fā)生肝臟衰竭，保護肝臟，甚至可以幫助患者迅速恢復肝臟功能，預防后遺癥。齊墩果酸(oleanolic acid，OA)為五環(huán)三萜類化合物，主要來源于木犀科植物齊墩果的葉[1]。女貞子的果實也含有豐富的齊墩果酸[2]。目前已經證實，齊墩果酸有抗氧化損傷的作用[3-5]。本研究采用四氯化碳(CCl4)制備肝急性氧化損傷模型，進一步探討齊墩果酸對肝急性氧化損傷的治療作用及相關機理。

1材料與方法

1.1　試劑與儀器

齊墩果酸來源于西安文竹生物科技有限公司(HPLC≥98%)，臨用時稱取3 g齊墩果酸溶解于10 mL豆油中，置37 ℃水浴超生30 min，制成濃度為300 mg/mL的齊墩果酸豆油混懸液。CCl4、鄰苯三酚、鹽酸、硫代巴比妥酸、三氯醋酸均購于天津市凱信化學工業(yè)有限公司。三氯醋酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-鹽酸(HCl)混合液的配置：稱取TCA 15 g,TBA 0.375 g，2.5 mol/mL HCl 10 mL加蒸餾水至100 mL，在50 ℃左右的水浴中溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。

TDZ5-WS離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)，BS224S電子天平(北京賽多利斯)，722型分光光度計(中國廈門分析儀器廠)，DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司)，尼康正置顯微鏡(NIU)。

1.2　動物分組及給藥方法

健康雄性SPF級ICR小鼠30只，4~5周齡，購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司[許可證號：SCXK(吉)-2011-0004]。動物采購后，置于實驗室適應1周，給予充足的食物和水。

隨機分成3個實驗組，分別為對照組、染毒組、齊墩果酸治療組，每組動物數(shù)為10只。對照組先給予3 mL/kg生理鹽水腹腔注射一次，24 h后給予豆油灌胃，1次/d，共干預2 d，灌胃劑量為0.1 mL/100 g。染毒組給予CCl4原液皮下注射一次，給予劑量為3 mL/kg，24 h后給予豆油灌胃，1次/d，共干預2 d，灌胃劑量為0.1 mL/100 g。齊墩果酸治療組先皮下注射3 mL/kg CCl4原液，24 h后給予齊墩果酸灌胃,1次/d，共干預2 d，灌胃劑量為0.1 mL/100 g。給水，禁食24 h,頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟備用。

1.3　肝臟臟器系數(shù)

準確稱取肝臟濕重，按照公式計算肝臟的臟器系數(shù)：肝臟濕重(g)/體重(g)×100%=臟器系數(shù)。

1.4　肝組織病理學檢測

切取肝臟左葉置于10%甲醛固定液中，固定24 h后進行常規(guī)的HE染色。

1.5　肝組織SOD含量的檢測

準確稱取肝組織0.5 g，加9倍生理鹽水，制成10%勻漿，2 500 rpm，離心10 min，取上清，鄰苯三酚法測定組織勻漿中的SOD含量。

1.6　肝組織MDA含量測定

準確稱取肝組織0.5 g，加入9倍體積的150 mmol/L KCl溶液，制成10%勻漿，2 500 rpm，離心10 min，取上清，置于4℃冰箱中待測。取2支試管,樣品管加1 mL勻漿液,2 mL TCA-TBA-HCl;空白管加1 mL KCl,2 mL TCA-TBA-HCl,混勻后，加塞，置于沸水浴中煮沸15 min，取出后立即冷卻至室溫。經4 000 rpm離心10 min，取上清于535 nm波長處比色測定，以空白管調零。

1.7　統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件及EXCEL2007進行處理分析。

2結果

2.1　齊墩果酸對急性肝臟氧化損傷小鼠肝臟臟器系數(shù)

由圖1可知，染毒組的肝臟臟器系數(shù)明顯高于對照組，經t檢驗其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明CCl4對小鼠的肝臟有毒性作用。齊墩果酸治療組的肝臟臟器系數(shù)高于對照組，經t檢驗其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此外，治療組的肝臟臟器系數(shù)也明顯高于染毒組，經t檢驗其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這一結果表明齊墩果酸對CCl4所致的小鼠急性毒性作用的治療作用不明顯，在CCl4引起急性損傷后給予齊墩果酸進行治療，達不到理想的治療效果。相反，可能會導致?lián)p傷進一步加重。

(與對照組比較，*P<0.05)

2.2　齊墩果酸對急性肝臟氧化損傷小鼠肝臟病理改變

從圖2可見，對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝血竇清晰可見，未見淤血或擴張。染毒組細胞排列紊亂，細胞質染色異常，細胞腫脹，細胞間界限不清。齊墩果酸治療組可見肝細胞核固縮，胞質濃縮，有空泡變性。

A:對照組；B:染毒組；C:OA治療組

2.3　齊墩果酸對急性肝臟氧化損傷小鼠肝臟SOD含量的影響

小鼠肝臟SOD含量檢測結果顯示(見圖3)，染毒組肝臟SOD的含量與對照組相比有降低的趨勢，經t檢驗分析其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，齊墩果酸治療組肝臟SOD含量與對照組相比也有降低的趨勢，經t檢驗分析其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。齊墩果酸治療組肝臟SOD含量與染毒組比較無明顯差異(P>0.05)。CCl4引起肝臟急性氧化損傷之后，再一次大劑量給予齊墩果酸治療，無法在短時間快速地清除損傷。

2.4　齊墩果酸對急性肝臟氧化損傷小鼠肝臟MDA含量影響

小鼠肝臟MDA含量檢測結果表明(見圖4)，與對照組相比，染毒組和齊墩果酸治療組小鼠肝臟MDA含量都明顯增加。齊墩果酸治療組MDA含量增加的更加明顯，且染毒組與對照組MDA含量比較，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，齊墩果酸組與對照組比較，其差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但是齊墩果酸治療組與染毒組MDA含量比較，其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這一結果表明齊墩果酸對CCl4導致的急性肝臟氧化損傷的治療作用不明顯，或者根本沒有治療作用。

(與對照組比較，*P<0.05)

圖 3OA對急性肝臟氧化圖 4OA對急性肝臟氧化

SOD損傷小鼠肝臟損傷小鼠肝臟MDA

含量的影響 含量的影響

3討論

CCl4經肝微粒體細胞色素P-450催化發(fā)生一電子還原，脫鹵生成三氯甲烷自由基(·CCl3)，·CCl3作用于生物膜，引起生物膜不飽和脂肪酸過氧化，改變了生物膜的流動性和通透性，胞質內Ca2+濃度升高，破壞細胞骨架，引起肝細胞損傷和壞死。本研究利用CCl4一次大劑量給予的方法制備小鼠急性肝臟氧化損傷模型，經肝臟臟器系數(shù)及組織病理學檢測發(fā)現(xiàn)模型組肝臟發(fā)生水腫變性。SOD是自由基清除劑，MDA是脂質過氧化損傷的重要標志。SOD水平降低、MDA含量水平升高表明機體受到自由基的侵害，出現(xiàn)了氧化損傷。本研究通過對SOD及MDA含量檢測，發(fā)現(xiàn)染毒組肝臟已經受到了氧自由基的損傷。上述結果表明，本研究利用CCl4誘導急性肝臟氧化損傷小鼠模型造模成功。

齊墩果酸有抗氧化、清除自由基的功效，對肝臟有一定的保護作用。有研究表明，提前給予齊墩果酸一次，可以保護CCl4導致大鼠的肝臟氧化損傷[6]。CCl4與齊墩果酸的不同給藥順序，可能會影響其干預效果。本課題組已經證實，損傷之前給予齊墩果酸，可以起到保護小鼠肝臟、清除自由基的作用[7]。本研究在CCl4腹腔注射24 h以后，立即給予受試小鼠齊墩果酸灌胃，觀察其對CCl4引起肝臟損傷的治療效果。齊墩果酸治療組的檢測結果表明，造模成功后再給予齊墩果酸灌胃，無法達到預期的治療效果，對肝臟沒起到保護作用。SOD和MDA含量檢測結果表明，齊墩果酸治療組與染毒組比較，差異沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。這表明齊墩果酸對CCl4導致的氧化損傷雖然沒起到治療作用，但也沒造成進一步、更嚴重的損傷。

參考文獻：

[1]孔陽，馬養(yǎng)民.大孔樹脂分離純化女貞子中齊墩果酸工藝的研究[J].陜西科技大學學報:自然科學版，2012,30(4):57-60.

[2]張蜀艷，李政.齊墩果酸研究進展[J].食品與發(fā)酵科技，2010,46(4)：22-24.

[3]戴云，邱曉燕，何耀瑩，等.齊墩果酸和熊果酸對DPPH自由基的清除作用[J].云南民族大學學報:自然科學版，2012,21(6):395-398.

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[5]魏海珍，張秀峰.齊墩果酸對損傷血管內皮細胞的保護作用及其機制探討[J].南京醫(yī)科大學學報:自然科學版，2012,32(11):1505-1510.

[6]Liu Yaping，Hartley DP，Liu Jie.Protection against carbon tetrachloride hepatotoxicity by oleanolic acid is not mediated through matallothionein[J].Toxicol Lett,1998,95(2):77-85.

[7]郗艷麗，吳啟坤，馮威，等.齊墩果酸對CCl4誘導小鼠急性肝損傷保護作用的實驗研究[J].吉林醫(yī)藥學院學報,2015,36(1):1-3.