碳量子點(diǎn)槲皮素復(fù)合物的制備及其抑菌性能研究

*通訊聯(lián)系人，男，副教授，博士.主要研究方向?yàn)樯锊牧匣瘜W(xué).E-mail:wangkj80@163.com

李紅霞，王興域，關(guān)鳳，王坤杰*，王吉財

(蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州730050)

摘要：在水相中采用葡萄糖化學(xué)氧化法合成了碳量子點(diǎn)，利用γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)對碳量子點(diǎn)表面進(jìn)行修飾，通過表面接枝法將槲皮素接枝在碳量子點(diǎn)表面，制備出了碳量子點(diǎn)/槲皮素復(fù)合物，并用IR、TEM、熒光分析對碳量子點(diǎn)和復(fù)合物進(jìn)行表征.選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌種，采用藥敏片法對制得的產(chǎn)品進(jìn)行了抑菌性能測試.結(jié)果表明，該方法制得的碳量子點(diǎn)粒徑均勻，分散性好.在紫外燈的照射下，碳量子點(diǎn)與碳量子點(diǎn)/槲皮素復(fù)合物分別呈現(xiàn)出明亮的藍(lán)色和綠色熒光.復(fù)合物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有明顯的抑菌作用，且明顯強(qiáng)于槲皮素.

關(guān)鍵詞：碳量子點(diǎn)；槲皮素；KH560；接枝法；抑菌活性

收稿日期：2015-04-21;修改稿收到日期:2015-06-01

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51063003);甘肅省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(1310RJYA017);蘭州理工大學(xué)紅柳青年教師培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(Q201211);蘭州理工大學(xué)博士科研啟動金資助項(xiàng)目

作者簡介：李紅霞(1979—) ，女，甘肅莊浪人，副教授，碩士.主要研究方向?yàn)椴牧匣瘜W(xué).E-mail:wangkj80@163.com

中圖分類號：O 611.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Synthesis,characterization and antimicrobial activity

of C-KH560-Quercetin composite

LI Hong-xia,WANG Xing-yu,GUAN Feng, WANG Kun-jie, WANG Ji-cai

(College of Petrochemical Technology,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,Gansu,China)

Abstract:Carbon quantum dots(CDs) is obtained by chemical oxidation of glucose in aqueous solution.The composites of C-KH560-Quercetin is prepared by grafting quercetin with CDs via KH560.The products are characterized by IR,PL and TEM,which confirm that the quercetin is grafted on the surface of KH560 modified CDs.The C-KH560-Quercetin composites demonstrate excellent antibacterial abilities against the Gram-positive S.aurous and Gram-negative E.coli in vitro.

Key words:carbon quantum dots;Quercetin;KH560;grafting method;antibacterial activity

槲皮素及其衍生物是廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)當(dāng)中的黃酮類化合物，也是人類飲食中最主要的生物類黃酮[1].作為一種天然藥物，槲皮素在抗腫瘤、抗炎、抗血小板聚集、抗自由基、抗病毒等方面具有較多應(yīng)用[2].為開發(fā)槲皮素更高的價值，提升其生物活性，通過對槲皮素進(jìn)行表面修飾，許多槲皮素類衍生物相繼被成功合成.近年來，以天然有機(jī)化合物為先導(dǎo)物，利用半合成法對其進(jìn)行修飾改性，已成為新藥開發(fā)的重要途徑[3].

量子點(diǎn)由于其獨(dú)特的性能已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注[4-8].與半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，碳量子點(diǎn)具有更優(yōu)異的性能，如低毒性、發(fā)光穩(wěn)定性、優(yōu)良的電子運(yùn)輸特性，且制備簡單，原料廣泛易得[9]，易于工業(yè)化生產(chǎn)[10]，這使得碳量子點(diǎn)這一新興的碳納米材料已廣泛用于生物成像、制備光電子器件、光催化等領(lǐng)域[11-13].因此，開展碳量子點(diǎn)的基礎(chǔ)研究，拓寬其應(yīng)用范圍具有重要的理論意義和應(yīng)用價值[14].

本文在水相中采用葡萄糖化學(xué)氧化法合成碳量子點(diǎn)，利用硅烷偶聯(lián)劑KH560對碳量子點(diǎn)表面進(jìn)行修飾，進(jìn)一步與槲皮素接枝，制備出了碳量子點(diǎn)/槲皮素復(fù)合物.最后測試了該復(fù)合物的抑菌性能，選取革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌種，采用藥敏片法對制得的產(chǎn)品進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn).

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與原料

葡萄糖(分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)，γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560，分析純，上海試劑一廠)，槲皮素(分析純，上海源葉生物科技有限公司)，二甲基亞砜(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，乙醇(純度95%，天津市化學(xué)試劑三廠)，氫氧化鈉(分析純，天津德恩化學(xué)試劑有限公司)，氯化鈉(分析純).國藥蛋白胨、牛肉膏和瓊脂(BR，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠).

1.2碳量子點(diǎn)的制備

在超純水體系中配制50 mL 1 mol·L-1的葡萄糖溶液和50 mL 1 mol·L-1的NaOH溶液，二者混合后，超聲處理4 h(超聲過程中溶液顏色逐漸加深，由無色透明逐漸變成暗紅色)，然后在電熱鼓風(fēng)干燥箱中80 ℃下干燥6 h.取少量上述干燥物(黑色)溶解于水，超聲10 min使其溶解后取20 mL上清液，用36%～38%的濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液至中性，隨著濃鹽酸的加入溶液由暗紅色逐漸變成棕黃色，然后在該溶液中點(diǎn)滴加入100 mL無水乙醇，滴加完畢后向該體系中加入2.5 g無水硫酸鎂攪拌20 min，溶液中產(chǎn)生淡黃色絮狀物，靜置48 h.將上清液置于真空干燥箱80 ℃下干燥24 h,收集上述干燥物即為C量子點(diǎn).

1.3C-KH560-槲皮素復(fù)合物的合成

取0.05 g C量子點(diǎn)溶于10 mL水中，然后點(diǎn)滴加入6～8滴KH560，超聲處理5 min.取0.2 g槲皮素溶解于10 mL 1 mol·L-1的氨水中，將槲皮素的氨水溶液加入到已處理的C量子點(diǎn)溶液中，超聲處理10 min，溶液呈現(xiàn)棕黃色.然后將上述混合液置于真空干燥箱60 ℃條件下干燥，即得C-KH560-槲皮素復(fù)合物.

1.4抑制細(xì)菌生長能力大小研究

選用革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌種,采用紙片擴(kuò)散法檢測樣品對兩種菌種的抑制生長作用.首先將50 μL經(jīng)活化過的菌種懸浮液涂布于固體培養(yǎng)基上，然后分別將在不同濃度樣品中浸泡過的圓紙片貼于上述含有菌種的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中四個紙片(平行三個，作空白對照)，最后在細(xì)菌培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的大小，同時采用體外紙片擴(kuò)散法測量最低抑菌濃度MIC值，整個實(shí)驗(yàn)過程中以無菌蒸餾水和亞硫酰氯作為空白對照.

2結(jié)果與討論

2.1紅外光譜分析

圖1是碳量子點(diǎn)(a)、槲皮素(b)及碳量子點(diǎn)/槲皮素復(fù)合物(c)的紅外光譜.從圖1a可以看出，在3 395,2 934,1 616 cm-1處是碳量子點(diǎn)的特征吸收峰.而復(fù)合物(c)的紅外圖中，1 606和1 274 cm-1是苯環(huán)的特征吸收峰，3 421和3 373 cm-1處出現(xiàn)的較強(qiáng)、較寬吸收峰為羥基分子間形成氫鍵的主要吸收峰.同時，與碳量子點(diǎn)(a)及槲皮素(b)的紅外圖相比，復(fù)合物(c)中1 112 cm-1處的吸收強(qiáng)度變大，表明待測復(fù)合物中C—H鍵數(shù)量增加，證明槲皮素被成功地接枝于C量子點(diǎn)表面.

圖1　 C量子點(diǎn)(a)、槲皮素(b)及碳量子點(diǎn)/槲皮素

2.2透射電鏡分析

圖2為C量子點(diǎn)(a)和碳量子點(diǎn)/槲皮素復(fù)合物(b)的透射電鏡，從圖可以看出，碳量子點(diǎn)的直徑在5～6 nm之間，碳量子點(diǎn)分散性較好、呈球狀顆粒，且粒徑分布均勻，而復(fù)合物出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，粒徑進(jìn)一步明顯變大.

2.3熒光分析

圖3中a和b分別為碳量子點(diǎn)和C-KH560-槲皮素在365 nm紫外燈照射下的熒光.可以看出，碳量子點(diǎn)和C-KH560-槲皮素復(fù)合物都具有熒光性，但是復(fù)合物的熒光略顯微弱，這可能是復(fù)合物發(fā)生了部分團(tuán)聚，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度輕微降低.

圖2　 C量子點(diǎn)(a)及碳量子點(diǎn)/槲皮素

圖3　碳量子點(diǎn)及C-KH560-槲皮素紫外照射下的熒光

圖4為碳的熒光發(fā)射光譜圖，可以看出，熒光半寬峰變窄，強(qiáng)度減弱.在500 nm處熒光曲線峰值發(fā)生變化，有較為良好的熒光性質(zhì).碳量子點(diǎn)最大發(fā)射峰位置紅移現(xiàn)象在很多研究中都有發(fā)現(xiàn)，原因可能是由于碳量子點(diǎn)表面發(fā)射位點(diǎn)的不同或者缺陷造成.同時，由于生成的碳量子點(diǎn)的分散性弱于酸性條件下生成的碳量子點(diǎn)，導(dǎo)致溶解性下降，熒光性質(zhì)減弱.

圖5為C-KH560-槲皮素的熒光光譜圖，可以看出，C-KH560-槲皮素有雙峰出現(xiàn)，具有雙熒光性質(zhì).原因可能是由于槲皮素本身具有一定的熒光性質(zhì)，而碳量子點(diǎn)也具有良好的熒光性，且碳量子點(diǎn)的熒光會隨粒徑范圍發(fā)生移動，而復(fù)合物的粒徑分布較寬，在用一定波長的光激發(fā)時，對應(yīng)不同粒徑范圍會出現(xiàn)不同的發(fā)射峰，所以當(dāng)槲皮素和碳量子點(diǎn)結(jié)合后出現(xiàn)雙峰，顯示出雙熒光性質(zhì).

圖4　碳的熒光發(fā)射光譜

圖5　C-KH560-槲皮素的熒光發(fā)射光譜

2.4最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)分析

表1是槲皮素和C-KH560-槲皮素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌最低抑菌濃度的平均值.槲皮素和C-KH560-槲皮素對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度值要小于對大腸桿菌的最低抑菌濃度值，說明槲皮素和C-KH560-槲皮素對金黃色葡萄球菌的抑菌性要比對大腸桿菌的抑菌性好；而C-KH560-槲皮素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度值均大于槲皮素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度值.說明碳量子點(diǎn)修飾后的槲皮素抑菌性能增強(qiáng).

表1　槲皮素和C-KH560-槲皮素最低抑菌濃度值

2.7抑菌活性實(shí)驗(yàn)

圖6a-b分別為槲皮素對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果圖，圖6c-d分別為C-KH560-槲皮素對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果圖.從圖6可以看出，槲皮素和C-KH560-槲皮素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較明顯的抑制生長作用，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果要比對大腸桿菌的抑菌效果好.從圖中還可以看出，復(fù)合物的抑菌能力明顯比槲皮素的強(qiáng)，說明復(fù)合物屬于廣譜抑菌劑.

a 5 mg·mL-1槲皮素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖；b 5 mg·mL-1槲皮素對大腸桿菌的抑菌效果圖；c 5 mg·mL-1C-KH560-槲皮素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖；d 5 mg·mL-1C-KH560-槲皮素對大腸桿菌的抑菌效果圖

圖6槲皮素和C-KH560-槲皮素的抑菌分析圖

Fig 6 Evaluation of the antibacterial effects by the

Quercetin and C-KH560-Quercetin

3結(jié)論

在水相中采用葡萄糖化學(xué)氧化法合成碳量子點(diǎn)，利用硅烷偶聯(lián)劑KH 560對碳量子點(diǎn)表面進(jìn)行修飾，進(jìn)一步與槲皮素接枝，制備出了碳量子點(diǎn)/槲皮素復(fù)合物.并借助IR，TEM和熒光等表征手段比較研究了碳量子點(diǎn)和復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)，通過體外抑制細(xì)菌生長能力實(shí)驗(yàn)檢測了該復(fù)合物對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑制能力.結(jié)果表明，該復(fù)合物具有高效的廣譜抑菌作用.

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(責(zé)任編輯陸泉芳)