固相萃取
--氣相色譜法測定茶葉中的角鯊烯

袁新躍 陳瑜 張培洪 胡路平 周陽元 袁燕村

（浙江省杭州市富陽區(qū)食品安全檢驗檢測中心，311400）

角鯊烯最初是從鯊魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的，1914年被命名為Squalene，其化學(xué)名稱為2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，屬開鏈三萜，又稱魚肝油萜，也稱鯊烯。角鯊烯具有抗氧化、抗輻射、抗疲勞和增強人體免疫的作用，可用于肝病治療，并具有一定的抗癌、防癌及保溫養(yǎng)顏作用。角鯊烯最早發(fā)現(xiàn)于深海鯊魚肝臟中，后研究人員從植物中提取得到不同含量的角鯊烯，近年來研究人員發(fā)現(xiàn)糯米香茶中含有豐富的生物活性物質(zhì)角鯊烯，使得糯米香茶成為提取角鯊烯的潛在植物資源，有待進一步開發(fā)利用。此外，鄭德勇等研究了角鯊烯在茶籽中生長成熟過程中含量的變化規(guī)律。大量的研究發(fā)現(xiàn)，茶葉籽中含有豐富的角鯊烯。本文建立一種固相萃取-氣相色譜法來準(zhǔn)確測定茶葉中角鯊烯含量的方法，為進一步研究茶葉中角鯊烯工作奠定了基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.儀器與試劑

氣相色譜儀（Agilent 7890A，美國），配火焰離子化檢測器（FID）；HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25mm×0.25μm），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA RV10）；氮吹儀；超聲波（2kw）。

正己烷（色譜純，默克公司）；乙腈（色譜純，默克公司）；石油醚（分析純，30～60℃沸程）等。

2.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

準(zhǔn)確稱取100.0mg角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶內(nèi)，加適量正己烷，振搖，使角鯊烯完全溶解后，再加正己烷，定容至刻度，搖勻，即配成1000μg/mL儲備液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別吸取 1000μg/mL 儲備液 1.0mL、2.0mL、5.0mL、8.0mL、10.0mL于100mL的容量瓶中，加正己烷定容至刻度，得到濃度分別為 10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

3.儀器條件

進樣口溫度：300℃；

檢測器溫度：330℃；

進樣體積：1μL;

升溫程序：160℃（保持2min），15℃/min升到280℃（保持5min），然后5℃/min升到300℃（保持2min）;

分流方式：不分流;

柱流速：2.5mL/min（恒流模式）;

尾吹氣：30mL/min;

載氣:高純氮氣(99.99%)。

4.樣品制備

稱取茶葉樣品10.00g，加入50mL石油醚浸泡，超聲提取1h，過濾，濾渣用10mL石油醚淋洗2次，合并濾液，于35℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，加入5mL正己烷溶解，過經(jīng)10mL乙腈甲苯溶液（乙腈∶甲苯=3∶1）活化，5mL正己烷平衡的Cleanert TPT小柱，再用10mL正己烷洗脫小柱，收集洗脫液，氮吹濃縮至近干，加入5mL正己烷溶解，過0.45μm膜，待上機檢測。

二、結(jié)果與分析

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

以1000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別配制成濃度為10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進樣體積為1μL。以濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，得到線性方程:y=23.5414x+3.2128，線性相關(guān)性R2=0.9999。取3倍信噪比（S/N=3）時，角鯊烯的檢出限為1mg/kg。

2.方法回收率

取茶葉樣品為對照（CK），分別添加濃度為10.0mg/kg、20.0mg/kg、50.0mg/kg的角鯊烯，按前述方法進行樣品前處理，測定不同添標(biāo)濃度和對照茶樣中的角鯊烯濃度，每個添標(biāo)濃度和參照茶樣均做3份平行，所得添標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。

表1 回收率實驗結(jié)果

表2 精密度實驗結(jié)果

表3 不同茶葉樣品中角鯊烯含量mg/kg

3.方法精密度

取茶樣樣品，按前述方法進行樣品前處理，做6份平行，所測濃度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。由表2可以看出，茶葉中角鯊烯測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%，說明方法具有良好的重復(fù)性。

4.樣品分析

應(yīng)用所建立的分析測定方法，對3種不同種類的茶葉樣品進行了分析，所得檢測結(jié)果見表3。圖2為烏龍茶茶樣中角鯊烯色譜圖。

三、討論

實驗結(jié)果表明：固相萃取-氣相色譜法測定茶葉中角鯊烯含量的方法，重現(xiàn)性好，目標(biāo)峰分離效果好，通過Cleanert TPT小柱脫色處理后，可以有效的去除干擾峰。方法在10～50 mg/kg的添標(biāo)水平，方法回收率在94.0%～100.6%，最低檢出限達(dá)到1mg/kg，可以滿足茶葉中角鯊烯含量測定的要求。實驗還對綠茶、紅茶和烏龍茶中的角鯊烯含量進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在綠茶、紅茶和烏龍茶中均有檢出角鯊烯，且烏龍茶中角鯊烯含量達(dá)到233.8mg/kg，這對進一步開發(fā)茶葉應(yīng)用價值，提高資源利用率有一定的意義。關(guān)于茶葉中角鯊烯含量測定國內(nèi)外還沒有文獻(xiàn)報道，因此本方法的建立將對以后茶葉中角鯊烯的研究提供一定的指導(dǎo)意義。

圖1 角鯊烯標(biāo)樣色譜圖（50μg/mL）

圖2 烏龍茶茶樣中角鯊烯色譜圖