玫瑰石斛原球莖的誘導(dǎo)與增殖研究

蘇 江，陳林發(fā)，鄧晰朝

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院， 廣西 宜州546300）

玫瑰石斛是蘭科石斛屬多年生草本植物［1］，含吲哚聯(lián)啶類生物堿，是具有滋陰益胃和生津除煩等功效的中藥材［2－6］。此外，玫瑰石斛花大而鮮艷，可供觀花和觀葉。但由于長(zhǎng)期過(guò)渡采收，目前野生玫瑰石斛資源急劇減少，甚至在有些地區(qū)已到瀕臨滅絕的境地。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)多種石斛屬植物如鐵皮石斛、美花石斛和霍山石斛等進(jìn)行了組培快繁方面的大量研究，以期保護(hù)野生藥用石斛資源，滿足日益增加的市場(chǎng)需求。關(guān)于玫瑰石斛組織培養(yǎng)及快速繁殖的研究鮮有報(bào)道，白音等研究發(fā)現(xiàn)，1／2MS＋馬鈴薯提取物20%有利于玫瑰石斛種子萌發(fā)［7］。而以玫瑰石斛植株莖段誘導(dǎo)原球莖，并將所得的原球莖進(jìn)行分化形成叢生芽，再將叢生芽培養(yǎng)成苗的研究尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)以玫瑰石斛植株莖段為材料，研究了不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及配比、附加物等因子對(duì)玫瑰石斛原球莖的誘導(dǎo)和增殖的影響，以期通過(guò)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)玫瑰石斛莖段獲得原球莖，并對(duì)原球莖進(jìn)行增殖，為進(jìn)一步誘導(dǎo)玫瑰石斛叢生芽和培養(yǎng)玫瑰石斛小苗提供大量的原材料，從而實(shí)現(xiàn)玫瑰石斛快速繁殖目的。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的玫瑰石斛植株購(gòu)于廣西宜州市中藥材市場(chǎng)，并經(jīng)河池學(xué)院鄧晰朝副教授鑒定。取生長(zhǎng)健壯植株的莖，并切成長(zhǎng)3～5cm的莖段作為外植體材料。放入廣口瓶中流水沖洗2h，再用洗衣粉水浸泡10～15min，清洗干凈后流水沖洗10～15min，待消毒處理。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 外植體的消毒試驗(yàn)

用體積百分比75%的酒精浸泡外植體材料25s，進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水沖洗3～4次，再用0．1%升汞進(jìn)行消毒，時(shí)間分別為5、6、7、8、9min。將外植體接種于培養(yǎng)基 MS＋I(xiàn)BA 0．2mg／L上，培養(yǎng)15d后統(tǒng)計(jì)污染率和成活率，從而確定最佳消毒時(shí)間。

1．2．2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)玫瑰石斛原球莖誘導(dǎo)的影響試驗(yàn)

以MS為基本培養(yǎng)基，并添加不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：6－BA（0、1、2mg／L），NAA（0、0．1、0．2mg／L），IBA（0．1、0．2mg／L），2，4－D（0．1、0．2mg／L），KT（1、2 mg／L）。將消毒好的玫瑰石斛莖段接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，觀察原球莖的誘導(dǎo)情況，比較原球莖的誘導(dǎo)時(shí)間與誘導(dǎo)率，篩選出適合誘導(dǎo)玫瑰石斛原球莖的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類，再通過(guò)正交試驗(yàn)選出最佳的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比濃度組合。

1．2．3 6－BA與NAA濃度對(duì)玫瑰石斛原球莖增殖的影響試驗(yàn)

以 MS為基本培養(yǎng)基，分別添加6－BA（1、2、3 mg／L），NAA（0．1、0．3、0．5mg／L）進(jìn)行原球莖增殖培養(yǎng)，試驗(yàn)共有9個(gè)處理，每個(gè)處理接種大小一致的原球莖，30d后觀察原球莖增殖情況。

1．2．4 添加不同附加物對(duì)玫瑰石斛原球莖增殖的影響試驗(yàn)

以MS為基本培養(yǎng)基，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為NAA 0．5mg／L＋6－BA 1．0mg／L，添加不同的植物添加物如椰汁、馬鈴薯、香蕉各15%，比較不同的植物添加物對(duì)球莖增殖的影響，30d后觀察原球莖增殖情況。

以上試驗(yàn)均于河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院組織培養(yǎng)恒溫?zé)o菌培養(yǎng)室進(jìn)行，培養(yǎng)溫度控制在（25±2）℃，光照強(qiáng)度2 000lx，每天光照12h。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)分析

以 Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 17．0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同消毒時(shí)間對(duì)玫瑰石斛外植體消毒效果的比較

以0．1%HgCl2對(duì)外植體進(jìn)行不同時(shí)間消毒處理。由表1可知，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率和成活率均呈下降趨勢(shì)，從消毒5min到7min污染率下降的幅度比較小，從消毒7min到9min污染率大幅度下降，而從消毒5min到9min成活率均是大幅度下降。綜合比較認(rèn)為，以0．1%HgCl2消毒8min比較適合玫瑰石斛莖段的消毒。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)玫瑰石斛外植體消毒效果的比較

2．2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)玫瑰石斛原球莖誘導(dǎo)的影響

由表2可以看出，不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)玫瑰石斛莖段誘導(dǎo)原球莖的影響有著明顯差異。從誘導(dǎo)時(shí)間來(lái)看，6－BA＋2，4－D組合誘導(dǎo)的時(shí)間都比較短，平均為20d；其次是6－BA＋NAA組合，誘導(dǎo)的時(shí)間平均為22d；KT＋NAA組合誘導(dǎo)的時(shí)間最長(zhǎng)，平均為25 d。從平均誘導(dǎo)率來(lái)看，6－BA＋NAA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的原球莖平均誘導(dǎo)率為46．91%，明顯高于其它植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合；而6－BA＋2，4－D組合和 KT＋NAA組合的原球莖平均誘導(dǎo)率基本相同，其誘導(dǎo)率分別為37．57%和37．69%；6－BA＋I(xiàn)BA組合的原球莖誘導(dǎo)率最低；綜合比較認(rèn)為，NAA、6－BA、2，4－D比較適合于玫瑰石斛莖段誘導(dǎo)原球莖。

表2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)玫瑰石斛原球莖誘導(dǎo)的影響

表3 NAA、6－BA和2，4－D正交設(shè)計(jì)水平

2．3 NAA、6－BA和2，4－D不同濃度配比組合對(duì)玫瑰石斛原球莖誘導(dǎo)的影響

以 MS為基本培養(yǎng)基，以 NAA、6－BA和2，4－D為因素，以它們各自的不同濃度為水平，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)的方法形成9個(gè)處理（見表3）。正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可以看出，不同處理的原球莖誘導(dǎo)率存在一定差異，其中處理2的誘導(dǎo)率最高，可達(dá)86．67%；處理9的誘導(dǎo)率最低，僅為14．28%。以原球莖誘導(dǎo)率為指標(biāo)，對(duì) NAA、6－BA 和2，4－D的不同配比組合對(duì)原球莖誘導(dǎo)率的影響進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見表4，從各因素的K值及極差（R）值可知，該試驗(yàn)因素A即6－BA濃度的R值最大為116．72，而 因素 C 即2，4－D濃度的 R 值最小，為35．16，因此，可初步推斷3種不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑影響玫瑰石斛原球莖誘導(dǎo)率的主次程度為A＞B＞C即6－BA＞NAA＞2，4－D。由 K 值的大小可初步推斷促進(jìn)玫瑰石斛原球莖誘導(dǎo)的 NAA、6－BA 和2，4－D 的不同濃度配比最優(yōu)水平的組合為A1B2C3，即 MS＋6－BA 0．5mg／L＋NAA 0．5mg／L＋2，4－D 2．0mg／L，該組合不在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中，需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

方差分析表明，6－BA和NAA對(duì)玫瑰石斛原球莖誘導(dǎo)率均有極顯著影響，2，4－D對(duì)玫瑰石斛原球莖誘導(dǎo)率的影響不顯著，見表5。根據(jù)直觀分析和方差分析，確定6－BA取0．5mg／L、NAA取0．5mg／L，而2，4－D可任意取一濃度水平。

對(duì)正交試驗(yàn)的優(yōu)選組合MS＋6－BA 0．5mg／L＋NAA 0．5mg／L＋2，4－D 2．0mg／L，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，共3次重復(fù)，平均誘導(dǎo)率為85．89%，其結(jié)果與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中的處理2相近，見表6。因此，NAA、6－BA和2，4－D的不同濃度配比最優(yōu)水平的組合為 A1B2C2，即 MS＋6－BA 0．5 mg／L＋NAA 0．5mg／L＋2，4－D 1．0mg／L，該組合最有利于玫瑰石斛原球莖的誘導(dǎo)。

2．4 6－BA與NAA濃度對(duì)玫瑰石斛原球莖增殖的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，以NAA和6－BA為因素，以它們各自的不同濃度為水平，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)的方法形成9個(gè)處理，見表7。正交試驗(yàn)結(jié)果見表8。

由表8可以看出，處理1平均增殖系數(shù)最高，達(dá)到9．37，而平均增殖系數(shù)最低的是處理9，僅為1．57。由極差R值可知，該試驗(yàn)6－BA濃度的R值大于NAA的R值，因此6－BA對(duì)玫瑰石斛原球莖增殖的影響大于NAA。根據(jù)K值的大小，可初步推斷促進(jìn)玫瑰石斛原球莖增殖的6－BA和NAA不同濃度配比最優(yōu)水平的組合為6－BA 1．0mg／L＋NAA 0．5mg／L，該組合與試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中3號(hào)處理一致。

表4 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)原球莖誘導(dǎo)影響的正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)原球莖誘導(dǎo)影響的正交試驗(yàn)方差分析

表6 優(yōu)選組合6－BA 0．5mg／L＋NAA 0．5mg／L＋2，4－D 2．0mg／L的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 6－BA和NAA正交設(shè)計(jì)水平

由方差分析，可知6－BA對(duì)玫瑰石斛原球增殖有極顯著影響，NAA對(duì)玫瑰石斛原球莖增殖的影響不顯著，見表9。根據(jù)直觀分析和方差分析，6－BA和NAA不同濃度配比最優(yōu)水平的組合為6－BA 1．0mg／L＋NAA 0．5 mg／L，該組合最有利于玫瑰石斛原球莖的增殖。

2．5 添加不同附加物對(duì)玫瑰石斛原球莖增殖的影響

由表10可知，在 MS＋NAA 0．5mg／L＋6－BA 1．0 mg／L培養(yǎng)基中分別附加香蕉、椰汁、馬鈴薯時(shí)，其增殖效果有一定的差異。其中添加椰子汁增殖效果最好，原球莖緊密且長(zhǎng)勢(shì)最好，顏色深綠，不分化；說(shuō)明椰子汁適合用于原球莖增殖，馬鈴薯次之；而添加香蕉對(duì)原球莖增殖效果較差，且培養(yǎng)過(guò)程中容易產(chǎn)生污染，說(shuō)明香蕉不適合用于玫瑰石斛原球莖增殖。因此，在進(jìn)行原球莖增殖時(shí)可適量添加椰子汁，從而達(dá)到提高原球莖增殖的目的。6－BA＋NAA組合、KT＋NAA組合和6－BA＋I(xiàn)BA組合均可誘導(dǎo)玫瑰石斛莖段產(chǎn)生原球莖，但從原球莖誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)率綜合比較，6－BA＋2，4－D組合誘導(dǎo)玫瑰石斛原球莖的時(shí)間都比較短，平均為20d；6－BA＋NAA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的原球莖平均誘導(dǎo)率明顯高于其它植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合。因此，NAA、6－BA、2，4－D比較適合于玫瑰石斛莖段誘導(dǎo)原球莖。在NAA、6－BA、2，4－D不同濃度配比組合正交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，6－BA對(duì)玫瑰石斛原球莖誘導(dǎo)的影響最大，其次是NAA，而2，4－D的影響最??；方差分析和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，NAA、6－BA和2，4－D的不同濃度配比最優(yōu)水平的組合為 MS＋6－BA 0．5mg／L＋NAA 0．5mg／L＋2，4－D 1．0mg／L，該組合最有利于玫瑰石斛原球莖的誘導(dǎo)，說(shuō)明低濃度的6－BA與NAA有利于原球莖的誘導(dǎo)，而2，4－D在誘導(dǎo)原球莖的過(guò)程中影響并不顯著，但加入2，4－D可以縮短誘導(dǎo)時(shí)間，因此，在玫瑰石斛原球莖的誘導(dǎo)中適當(dāng)添加2，4－D是有利的。

表8 6－BA與NAA對(duì)玫瑰石斛原球莖增殖影響的正交試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

植物組織培養(yǎng)中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是最重要的影響因素，不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)培養(yǎng)物質(zhì)的生長(zhǎng)有重要作用［8－9］。

本試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，并分別添加不同濃度的6－BA、NAA、IBA、2，4－D 和KT，以期獲得適合玫瑰石斛莖段誘導(dǎo)原球莖的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、濃度和最佳組合。結(jié)果表 明，6－BA＋2，4－D 組 合、

表9 6－BA與NAA濃度對(duì)玫瑰石斛原球莖增殖的影響方差分析

表10 添加不同附加物對(duì)玫瑰石斛原球莖增殖的影響

通過(guò)原球莖的增殖和分化獲得實(shí)生苗是石斛屬快速繁殖的有效途徑，目前關(guān)于玫瑰石斛原球莖增殖和分化的研究還鮮有報(bào)道。因此，建立玫瑰石斛原球莖增殖體系，對(duì)加快玫瑰石斛快速繁殖具有重要的實(shí)踐意義。本試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6－BA和NAA并利用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行原球莖增殖培養(yǎng)，結(jié)果表明，6－BA對(duì)玫瑰石斛原球莖增殖的影響大于NAA，二者不同濃度配比最優(yōu)水平的組合為6－BA 1．0mg／L＋NAA 0．5mg／L，該組合最有利于玫瑰石斛原球莖的增殖。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在MS＋NAA 0．5mg／L＋6－BA 1．0mg／L培養(yǎng)基中分別添加香蕉、椰汁、馬鈴薯時(shí)，對(duì)玫瑰石斛原球莖的增殖均有不同程度的影響，其中添加椰子汁增殖效果最好，原球莖緊密且長(zhǎng)勢(shì)最好，顏色深綠，不分化。因此，在進(jìn)行原球莖增殖時(shí)可適量添加椰子汁，以達(dá)到提高原球莖增殖的目的。

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