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      抗真菌肽Drosomycin在原核生物表達系統(tǒng)中的可溶性表達

      2016-01-17 17:21:56吳文梅李彩婷楊婉瑩
      廣東蠶業(yè) 2016年3期
      關鍵詞:果蠅咪唑質粒

      吳文梅 李彩婷 楊婉瑩*

      (華南農業(yè)大學動物科學學院,廣州 510642)

      真菌是生物界中很大的一個類群,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對人類有致病性的真菌約有300多個種類[1]。市面上所用抗真菌類藥物,副作用大,易產生抗藥性[2]。而抗真菌肽卻有望解決這些弊端。

      抗真菌肽Drosomycin來自于果蠅,屬于天然蛋白質,相對分子質量小,熱穩(wěn)定性好,遇水易溶解,可作為抗生素的替代品,為我們解決抗生素耐藥性提供新材料[3][4]。楊婉瑩等從2002年開始對抗真菌肽及其家族蛋白的研究,結果表明Drosomycin對絲狀病原真菌具有廣譜的抑制活性,可以作為新的抗真菌藥物的靶標[5][6][7]。但Drosomycin在果蠅體內含量極微,天然資源有限,提取步驟煩瑣、成本高,得率低,不利于工業(yè)生產[8]。因此利用分子生物學技術進行體外表達成為研究熱點。

      Drosomycin成熟肽包括44個氨基酸,其中8個半胱氨酸形成4對二硫鍵,由于結構的復雜性,在利用原核系統(tǒng)表達該蛋白時往往形成包涵體,后續(xù)純化復性步驟復雜,不利于實際利用。本實驗利用大腸桿菌原核生物表達系統(tǒng),通過對冷休克表達載體pcold TF進行改造,實現(xiàn)Drosomycin體外的可溶性表達,為下一步生產應用奠定基礎,同時為探索富含二硫鍵的蛋白在體外的分離純化提供一條線索。

      1 材料與方法

      1.1 材料,質粒

      果蠅細胞sf9由本實驗室保存,大腸桿菌E.coli(DH5α)感受態(tài)細胞,BL21(DE3)感受態(tài)細胞均購自北京天根生物公司;質粒pCold TF由崔玉寶教授贈送。

      1.2 酶類及其他試劑

      胰蛋白胨(Tryptone)、酵母抽提物(Yeast Extract)、氯化鈉(NaCl)為上海生物生工有限公司產品;氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)、異丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)、X-gal、預染蛋白Marker購自廣州翔博生物技術有限公司;蛋白質 Maker、RNA酶A,Western blot膜封閉液購自北京天根生物公司;Trizol Reagents總RNA抽提試劑盒,各規(guī)格DNA Marker、限制性內切酶(NdeⅠ、XhoⅠ)、PCR聚合酶、反轉錄用試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)、T4 DNA ligase、pMD19-T 載體、Primer-STAR DNA 聚合酶、dNTP Mixture(各 10 mmol/L)均購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;鼠抗Penta-His抗體購置碧云天生物技術有限公司;HRP-兔抗鼠結合物購自北京全式金生物技術有限公司;Ni-NTA親和層析填料鎳購自伯樂生物科技有限公司。其他化學試劑均是國產分析純。

      1.3 方法

      1.3.1 果蠅細胞sf9的DNA提取

      取實驗室培養(yǎng)的果蠅細胞sf9,待平板長到80%-90%時,加入Trizol裂解細胞,隨后將平板中的細胞轉入1.5 ml的EP管中,按照常規(guī)方法氯仿/異丙醇步驟變性蛋白質,抽提其RNA[9],最后利用試劑盒將其反轉錄成DNA,于-20℃保存。

      1.3.2 抗真菌肽Drosomycin基因的PCR擴增

      根據(jù) NCBI上已登錄 (NM079177)的Drosomycin(Drs)基因序列設計了一對引物,上游引物 Drs-F:5’-CGCCATATGGACTGCCTGTCCGG-3’(橫線所示為NdeⅠ酶切位點),下游引物 Drs-R:5’-CCGCTCGAGTTAGCATCCTTCGCA-3’(橫線所示為 XhoⅠ酶切位點),引物由上海生物生工有限公司合成。

      以抽提果蠅的DNA為模板,用上述引物擴增Drs編碼基因,PCR反應體系包括TaKaRa Taq (5 U/μl) 0.25 μl;10×PCR Buffer(Mg2+Plus)5 μl;dNTP Mixture(各2.5 mM) 4 μl;上游引物(20 μM)1 μl;下游引物(20 μM) 1 μl;cDNA First-strand 1μl,添加滅菌ddH2O至總體積為50 μl。PCR反應:預變性98℃ 5 min,變性98℃30 s,退火 55 ℃ 30 s,延伸 72 ℃ 30 s,32個循環(huán),延伸72℃ 10 min。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,用天根膠回收試劑盒切膠回收目的基因。

      1.3.3 重組載體pCold TF-Drs的構建

      質粒pCold TF和體外擴增的目的基因Drs用限制性內切酶Nde I和XhoI進行雙酶切,50 μl酶切體系為:質粒DNA/Drs 30 μl,10xH bueffr 5 μl,XhoI 2.5 μl,NdeI 2.5 μl,加 ddH2O 10 μl補足 50 μl酶切體系,37℃酶切8 h。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物,在紫外燈下用無菌手術刀片切下線狀載體DNA和PCR產物的條帶,按膠回收試劑盒說明書操作,回收目的載體片段和PCR產物。將Drs的酶切純化產物和表達載體pCold TF的酶切純化產物于16℃連接8 h,反應體系10 μl:PCR純化產物5 μl,pCold TF 酶切產物 3 μl,T4 ligase 1 μl,T4 ligase buffer 1 μl. 然后轉化進大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細胞。將通過菌液PCR鑒定成功的重組質粒送上海生工測序。

      1.3.4 重組載體pCold TF-Drs的誘導表達及SDS-PAGE鑒定

      將測序正確的pCold TF-Drs轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,利用含有Amp(氨芐青霉素)抗性的平板篩選陽性重組子。將篩選成功的含有pCold TF-Drs重組菌BL21(DE3)單菌落,接種到LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)箱過夜振蕩培養(yǎng),然后取菌液按1:100體積比轉接LB培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)3 h至 OD600nm=0.4-0.5左右,添加IPTG 0.5 mM進行誘導表達,15℃培養(yǎng)24 h。收集細菌,用適量PBS重懸后進行超聲破碎,超聲6 s,間隔10 s,超聲90次,菌體破碎液用低溫離心機進行收集,10 000 r/min,4℃,離心30 min,分別取全蛋白、超聲破碎上清、超聲破碎沉淀各16 μl,加入4 μl 5X SDS loading buffer,100℃加熱10 min變性蛋白,用12%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳,結束后用考馬斯亮藍G250染色。

      1.3.5 Western blot鑒定

      按上述方法進行SDS-PAGE,然后將蛋白轉至PVDF膜,電泳儀參數(shù)設置為電壓100 V,70 min,將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉中,至搖床上室溫封閉30 min;倒出封閉液,加入4 ml脫脂奶粉稀釋的一抗(抗His標簽鼠單抗),稀釋比例為1:1 000,盡可能排除氣泡,于搖床4℃雜交過夜。使用后回收一抗;去除一抗后將膜用20 ml TBST清洗3次,每次置于搖床清洗10 min;將膜置于新的平皿中,加入4 ml脫脂奶粉稀釋的二抗(HRP標記山羊抗小鼠IgG),稀釋比例為1:1 000,至搖床上室溫孵育2 h以上;去除一抗后將膜用20 ml TBST清洗3次,每次置于搖床清洗10 min;將洗好的PVDF膜置暗房中,滴加發(fā)光液進行化學發(fā)光顯色,X光膠片曝光顯影定影后保存膠片。

      1.3.6 融合蛋白的分離純化

      重組融合蛋白的純化是通過Ni-NTA親和層析柱完成,具體過程主要包括以下步驟:先取一定量的Ni-NTA填料,加到柱子里,用10個柱體積的PBS對柱子進行洗滌與平衡;蓋緊下面的帽子,取超聲破碎的上清加入到柱子中,蓋緊上面的帽子,4℃,旋轉混勻30 min;固定柱子,摘掉兩個帽子,讓溶液全部自然流下,收集樣品,用于檢驗;用含有25 mM咪唑的PBS清洗柱子,直到OD280沒有變化時,停止洗滌;分別用含有25 mM,50 mM,100 mM,150 mM,300 mM 咪唑 Tris洗脫柱子上的目的蛋白,收集蛋白,通過SDS-PAGE進行染色檢測是否干凈;用含有1 M咪唑的Tris,清洗柱子,使柱子上的蛋白完全洗下來;用0.5 M NaOH清洗柱子;用20%酒精保存柱子。分別檢驗不同濃度的咪唑洗脫液中的蛋白,取收集的各管蛋白制樣,進行SDS-PAGE檢測,檢測洗脫目的蛋白的最適咪唑濃度。

      2 結果與分析

      2.1 重組載體pCold TF-Drs的構建

      以果蠅的DNA為模板,PCR擴增目的基因Drosomycin,電泳檢測目的條帶符合預期大?。▓D1)。切膠回收目的條帶,酶切后連接到pCold TF載體上,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(圖2),將構建成功的重組載體pCold TF-Drs送上海生物生工公司測序,結果與預期的一致。

      2.2 質粒pCold TF-Drs原核表達及鑒定

      取測序成功的重組質粒pCold TF-Drs轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,挑取單菌落培養(yǎng)至OD600為0.4用IPTG進行誘導,15℃培養(yǎng)24 h,離心收集菌體超聲破碎,收集樣品進行SDS-PAGE電泳,并進行Western-blotting檢測,結果如圖3、圖4所示。從圖中可以看出融合蛋白TF-Drs表達的蛋白質相對分子質量大小為60 ku(所含Drs為5 ku),與預期結果一致。Western blot結果也顯示攜帶His標簽的融合蛋白可以與鼠抗Penta-His抗體識別。

      2.3 融合蛋白pCold TF-Drs的分離純化

      將15℃表達的細菌裂解液上清,通過Ni-NTA柱親和層析純化,洗脫咪唑濃度梯度依次為20 mM、40 mM、60 mM、300 mM。分別取每個濃度梯度的洗脫液,進行12%SDS-PAGE檢測,檢測結果如圖5所示,可見:細菌裂解液上清中呈可溶性表達,融合蛋白pCold TF-Drs在Ni-NTA柱洗脫咪唑濃度為300 mM時,洗脫純化效果最好。經Ni-NTA柱親和層析純化,獲得300 mM咪唑的洗脫液,進一步使用分子篩SephadexP-10層析柱去除咪唑和脫鹽。脫鹽后的融合蛋白再使用10 KDa的超濾管進行超濾濃縮,獲得的融合蛋白pCold TF-Drs經SDS-PAGE檢測,表明融合蛋白得到很好的純化(圖6)。

      圖1 目的基因Drs擴增電泳圖

      圖2 pCold TF與Drs雙酶切回收電泳圖

      圖3 融合蛋白TF-Drs的SDS-PAGE檢測

      圖4 融合蛋白TF-Drswestern blot檢測

      圖5 融合蛋白TF-Drs的Ni-NTA純化

      圖6 融合蛋白TF-Drs的脫鹽純化

      3 討論與結論

      大腸桿菌原核生物表達系統(tǒng)由于其生長周期短,生長速度快,轉化外源DNA操作簡單,可以大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng),被認為是一種體外合成重組蛋白最簡單的外源表達系統(tǒng),但是多數(shù)情況下外源表達產物形成非活性的包涵體蛋白,不利于后續(xù)實驗[10]。本實驗室前期構建過pET 3C-Drs表達質粒,轉化進大腸桿菌BL21(DE3)后,目的蛋白主要以包涵體的形式表達,需要變性,復性,不利于生產操作[11]。pCold TF-Drs作為表達載體與pET系列載體對比而言,它具有TF標簽可以促進目的蛋白的可溶性表達,純化簡單,標簽容易移除。同時,它還是是一個低溫冷休克表達載體,表達目的蛋白穩(wěn)定[12]。

      通過本次實驗,確定了將目的基因抗真菌肽Drosomycin定向克隆到原核生物表達載體pCold TF后,將構建正確的重組載體pCold TF-Drs轉化大腸桿菌 BL21(DE3),IPTG誘導外源蛋白表達,SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)獲得的目的蛋白相對分子質量單位為60 kDa,與預期值(55 kDa+5 kDa=60 kDa)相一致。Western Blot結果也表明,該蛋白可被鼠抗His抗體識別,表明在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達的蛋白是目的蛋白。通過超聲破碎 pCold TF-Drs轉化菌(BL21),用SDS-PAGE顯示其大部分在上清中,表明是可溶性表達。

      本實驗成功構建了重組質粒pCold TF-Drs,實現(xiàn)了目的蛋白在原核生物表達系統(tǒng)中的可溶性表達,為下一步酶切純化出抗真菌肽Drosomycin實現(xiàn)生產上的利用,對植物類病原真菌的抑菌活性檢測,藥理藥效的研究以及開發(fā)抗真菌藥物奠定了基礎。

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