人羊膜上皮細(xì)胞抗細(xì)胞衰老作用的研究進展

尉遲海深, 林金德

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綜 述

人羊膜上皮細(xì)胞抗細(xì)胞衰老作用的研究進展

尉遲海深, 林金德

人羊膜上皮細(xì)胞; 細(xì)胞衰老; 抗衰老

細(xì)胞衰老是細(xì)胞在執(zhí)行生命活動過程中，隨著時間的推移，細(xì)胞增殖與分化能力和生理功能逐漸發(fā)生衰退的變化過程。人們對細(xì)胞衰老機制的研究由來已久，目前主要有差錯理論、程序理論及端粒學(xué)說。細(xì)胞衰老可以促使生物衰老，不僅可以導(dǎo)致組織器官功能減弱與喪失，而且與惡性腫瘤、心衰、糖尿病等多種重要疾病的發(fā)生有關(guān)。因此，深入研究細(xì)胞衰老和抗衰老的機制有著重要意義。近年來，國內(nèi)外大量的實驗研究表明[1-7]，人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells, HAECs)具有較強的抑制細(xì)胞分化、促進細(xì)胞增殖、增強細(xì)胞活力和功能、保護細(xì)胞免受不良影響的傷害，以及抑制細(xì)胞凋亡的作用，為抗細(xì)胞衰老研究提供了嶄新的路徑?，F(xiàn)筆者就HAECs的生物學(xué)特性，以及其用于抗細(xì)胞衰老的研究方法和成果作一綜述。

1 HAECs的生物學(xué)特性

HAECs存在于分娩后胎盤上的羊膜組織中，是由受精卵發(fā)育至第8天的囊胚內(nèi)細(xì)胞團分化而來，具有分化潛能，可向3個胚層組織分化。在合適的誘導(dǎo)條件下，HAECs可分化為肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。它是一類具有干細(xì)胞特性的上皮細(xì)胞，表達干細(xì)胞標(biāo)志分子及相關(guān)基因，如CD133，CD271，TRA-1-60,Oct3/4，SOX-2，SSEA-4和Klf 4[8]，但不表達干細(xì)胞中的端粒酶基因。端粒酶可以保護染色體的末端，保證DNA不在復(fù)制過程中縮短，從而使細(xì)胞永生化。因此，HAECs不能無限增殖，不能看做嚴(yán)格意義上的干細(xì)胞。細(xì)胞表面不表達HLA-A、B、C和DR抗原，因抗原性極低，同種異體移植后不會引起免疫排斥反應(yīng)。1998年，K Imakawa等研究發(fā)現(xiàn)，羊膜可分泌大量的細(xì)胞因子，如表皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子(神經(jīng)營養(yǎng)素、神經(jīng)細(xì)胞分裂素、成纖維細(xì)胞生長因子、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、胰島素樣生長因子等)、轉(zhuǎn)化生長因子-β、堿性成纖維細(xì)胞生長因子等，這些生長因子均有一定的促進細(xì)胞增殖和抗衰老作用。另外，如白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑、白細(xì)胞介素18等抗凋亡因子在HAECs中也有較強表達。HAECs的抗衰老作用主要通過這些可溶性生物因子而發(fā)揮作用。

2 HAECs對細(xì)胞衰老的影響

大量方法用于研究HAECs對細(xì)胞衰老的影響[1,9-14]，概括起來主要包括：⑴條件培養(yǎng)液。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞會分泌活性物質(zhì)到培養(yǎng)液中，這種培養(yǎng)過某種細(xì)胞以后含有該種細(xì)胞分泌物的培養(yǎng)液，叫做該種細(xì)胞的條件培養(yǎng)液。條件培養(yǎng)液的制備大致包括：細(xì)胞培養(yǎng)、收集上清液、離心除去細(xì)胞碎屑、濃縮保存等步驟。人羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液(human amniotic epithelial cells conditioned medium, AMCM)保留了細(xì)胞在生長過程中分泌的全部細(xì)胞因子，含量最為豐富，使用方便，應(yīng)用較為廣泛。⑵飼養(yǎng)層細(xì)胞。在正常機體內(nèi)，細(xì)胞除了獲得一些來自血液的營養(yǎng)外，還在細(xì)胞與細(xì)胞之間互換特殊的物質(zhì)，用于分裂、分化和營養(yǎng)等。因而，在細(xì)胞體外培養(yǎng)中，除了正常的培養(yǎng)基外，先培養(yǎng)一層特殊的細(xì)胞，然后再在其上接種要實驗的細(xì)胞，這些特殊的細(xì)胞就是飼養(yǎng)層細(xì)胞。該細(xì)胞可以提供給實驗細(xì)胞更好的營養(yǎng)，而大多數(shù)的分化研究則必須有飼養(yǎng)層細(xì)胞。以HAECs作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，主要用于研究前者對其他細(xì)胞分化的影響。⑶細(xì)胞移植。HAECs也可用于活體實驗，成功移植并存活于實驗動物體內(nèi)的HAECs，主要通過旁分泌的方式發(fā)揮作用。⑷去細(xì)胞羊膜。去細(xì)胞羊膜是將新鮮羊膜組織用中性蛋白酶消化去除上皮細(xì)胞層，便于儲存。去細(xì)胞羊膜組織中吸收了羊膜上皮細(xì)胞分泌的大量有活性的細(xì)胞因子，且不易流失。⑸羊膜提取液。將羊膜組織中所吸收的羊膜上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子重新溶解釋放，獲得的羊膜提取液，也廣泛用于研究。

3 HAECs的抗衰老作用與機制

3.1 抑制細(xì)胞分化 HAECs作為飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)人角膜上皮祖細(xì)胞，比傳統(tǒng)的3T3生物飼養(yǎng)層能更有效地促進集落的生長[1]。這些細(xì)胞體積更小，保持更強的增殖能力，且具有更高水平的干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志分子表達，如P63、Mucashi-1和ABCG2等。Lai等[2]的研究顯示，培養(yǎng)在HAECs上的胚胎干細(xì)胞可以保持未分化狀態(tài)而長時間生長，保持原代細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和分子標(biāo)志，在抑制細(xì)胞分化方面較傳統(tǒng)的鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層更具優(yōu)勢。羊膜來源于多潛能祖細(xì)胞與單核細(xì)胞共培養(yǎng)，前者可明顯抑制單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞的分化成熟。共培養(yǎng)環(huán)境中的單核細(xì)胞保留了未分化的標(biāo)志分子CD14，同時由單核細(xì)胞分化的樹突狀細(xì)胞的成熟標(biāo)志分子CD83、CD1a也明顯減少，這表明羊膜來源多潛能祖細(xì)胞對單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化的抑制作用[3]。

HAECs抑制細(xì)胞分化的作用機制之一，與其分泌的白細(xì)胞介素抑制因子(Interleukin inhibitory factor， LIF)有關(guān)[5]。以高表達LIF的HAECs作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)精原干細(xì)胞；精原干細(xì)胞可以長時間培養(yǎng)，并保持未分化狀態(tài)。與表達較少的LIF人羊膜上皮飼養(yǎng)層細(xì)胞相比，高表達LIF的HAECs可使精原干細(xì)胞表達更多的特異性干細(xì)胞表面標(biāo)志。最近的研究還顯示，HAECs作為飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)，可通過抑制誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(iPSCs)內(nèi)源性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的生成來抑制其分化，保持其多分化潛能、旺盛的增殖潛能和自我更新能力[5]。

3.2 促進細(xì)胞增殖 與培養(yǎng)在普通培養(yǎng)液中的角膜上皮細(xì)胞相比，加入20%的AMCM后，細(xì)胞的增殖能力、集落形成能力明顯提高。細(xì)胞周期中，G1期比例明顯下降，G2期、S期比例明顯上升，并且表現(xiàn)出與原代細(xì)胞相似的細(xì)胞間連接和細(xì)胞泵功能[6]。近期，關(guān)于HAECs促進皮膚再生的研究也表明，HAECs可促進Ki-67陽性細(xì)胞的比例，表明細(xì)胞的增殖能力提高[7]。

2006年，JH Lee 等認(rèn)為，AMCM可促進角膜上皮細(xì)胞的增殖能力和DNA合成能力；進一步研究顯示，AMCM可促使角膜上皮細(xì)胞自身合成和分泌胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，呈時間-劑量依賴關(guān)系，即在一定范圍內(nèi)，隨著AMCM濃度的升高和作用時間的延長，角膜上皮細(xì)胞合成的IGF-1逐漸增加；角膜上皮細(xì)胞合成的IGF-1是促進自身增殖能力的重要機制。另外，這種促進細(xì)胞增殖的作用，也可能與HAECs使其他細(xì)胞的細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，如細(xì)胞周期蛋白D1，D3和MDM2表達水平增高有關(guān)[9]。

3.3 增強細(xì)胞活力與功能 國外學(xué)者的研究表明[10]，將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium cells， RPE)接種在去細(xì)胞羊膜上生長，用real time-PCR定量分析與RPE細(xì)胞特異功能密切相關(guān)的數(shù)個基因的表達情況，如RPE65、CRALBP、Bestrophin氯離子通道蛋白和酪氨酸酶相關(guān)蛋白，與生長在塑料培養(yǎng)皿上的細(xì)胞相比，這些特異性基因的表達水平明顯上調(diào)，表明羊膜(amniotic membrane, AM)可以抑制RPE細(xì)胞功能的退化，

Skvorak 等[11]的細(xì)胞移植實驗，從細(xì)胞的新陳代謝方面闡釋了部分機制。HAECs移植入鼠體內(nèi)后，可影響細(xì)胞的新陳代謝，使模型鼠受損神經(jīng)細(xì)胞與能量代謝相關(guān)的多種氨基酸含量和與蛋白質(zhì)代謝(尿素循環(huán))相關(guān)的多種氨基酸含量有明顯改善。受損神經(jīng)細(xì)胞受HAECs影響后，其合成5-羥色胺、多巴胺、γ氨基丁酸等神經(jīng)遞質(zhì)的能力明顯恢復(fù)。Xiao 等[12]則證明，AMCM可明顯增加角膜上皮細(xì)胞生物膜表面的鈉泵、水通道蛋白等多種離子通道蛋白，這些蛋白通道在保持細(xì)胞正常體積方面發(fā)揮著決定性的作用，其可以清除多余的水和多種離子，使細(xì)胞保持旺盛的活力和功能。3.4 保護作用和抑制細(xì)胞凋亡 2003年，S Uchida 等研究表明，視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞在無血清培養(yǎng)液中加入AMCM后，惡化的細(xì)胞形態(tài)得到明顯改善，細(xì)胞的存活率明顯提高，而且比加入幾種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)等的效果要好數(shù)倍。同年，K Kakishita等研究表明，AMCM可明顯增加多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞無血清培養(yǎng)液中的存活率，并可保護細(xì)胞形態(tài)的完整性免受毒物6-羥基多巴的破壞；HAECs移植入腦內(nèi)后，可發(fā)揮保護作用，與對照組相比，受毒物影響的多巴胺神經(jīng)元的存活率明顯提高。HAECs移植，還可以減輕機械拉力造成的神經(jīng)纖維損傷。將HAECs移植在拉傷的臂叢神經(jīng)組織周圍，可使神經(jīng)纖維的機械抗拉性能和病理形態(tài)得到明顯改善，受損的神經(jīng)傳導(dǎo)功能也可顯著恢復(fù)[13]。

HAECs抑制細(xì)胞凋亡的作用機制較復(fù)雜。Xiao等[12]研究表明，AMCM可明顯減少角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)活性氧族的含量，減少氧自由基對DNA的破壞和細(xì)胞代謝活動的不利影響；并可抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白P53的表達，抑制P53引發(fā)的細(xì)胞凋亡通路，增加抑制凋亡相關(guān)蛋白Survivin的表達。2006年，CC Sun等通過反轉(zhuǎn)錄PCR、定量PCR和酶聯(lián)免疫分析的方法表明，去細(xì)胞羊膜可促使角膜上皮細(xì)胞表達大量的白細(xì)胞介素-1受體抑制劑，通過此路徑抑制角膜上皮細(xì)胞的凋亡。2003年，馬翔等研究發(fā)現(xiàn)，AMCM對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)受HAECs影響后，角膜基質(zhì)細(xì)胞的Bcl2基因表達明顯增加，推測凋亡抑制相關(guān)基因Bcl2在此過程中發(fā)揮重要的作用。最新的關(guān)于HAECs移植抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的研究同樣發(fā)現(xiàn)，HAECs移植后，顆粒細(xì)胞Bcl2基因表達明顯增加，Caspase-3、Bax基因表達明顯減少，Bcl2/Bax的比例升高，驗證并補充了前人的研究成果[14]。

綜上所述，HAECs是一種具有干細(xì)胞特性和很高分化潛能的新型細(xì)胞，抗原性極低，同種異體移植后不會引起免疫排斥反應(yīng)；其可以旺盛地分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子是其發(fā)揮抗衰老作用的基礎(chǔ)。大量的研究表明，其抗衰老作用具體表現(xiàn)在抑制細(xì)胞分化、促進細(xì)胞增殖、增強細(xì)胞活力和功能、保護細(xì)胞免受不良影響的傷害和抑制細(xì)胞凋亡等方面。盡管HAECs產(chǎn)生的抗衰老因子有待于進一步鑒定，以及其單獨的作用機制和合力作用機制有待于進一步研究，但HAECs作為一種新的富有希望的研究對象，必將對抗衰老的實驗研究和臨床研究產(chǎn)生深遠的影響。

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210009 江蘇 南京，南京醫(yī)科大學(xué)附屬友誼整形外科醫(yī)院 整形外科

尉遲海深(1988-)，男，河南南陽人，碩士研究生.

林金德，210009 ，南京醫(yī)科大學(xué)附屬友誼整形外科醫(yī)院 整形外科，電子信箱：hzljd@sohu.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.05.016

2016-03-14)