自體富血小板血漿對自體脂肪顆粒移植存活作用的研究進(jìn)展

譚流暢，馬桂娥

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自體富血小板血漿對自體脂肪顆粒移植存活作用的研究進(jìn)展

譚流暢，馬桂娥

富血小板血漿； 脂肪移植； 脂肪存活率;血管化； 脂肪來源干細(xì)胞； 前脂肪細(xì)胞； 增殖分化

1 背景介紹

1893年F Neuber首次提出自體脂肪移植，脂肪移植作為一種自體填充材料用于腫瘤切除術(shù)后、先天畸形、創(chuàng)傷等軟組織缺損的修復(fù)，被廣泛應(yīng)用于整形外科和其他相關(guān)領(lǐng)域[1]。由于脂肪組織具有生物相容性和再生修復(fù)作用，因此脂肪注射也被用于瘢痕、放射治療后、免疫相關(guān)軟組織缺損[2-3]的修復(fù)。盡管自體脂肪移植有許多優(yōu)點，如具有良好的生物相容性、較容易獲得、移植后形態(tài)自然，但是移植后脂肪存活數(shù)量的不確定性和脂肪液化壞死等問題一直存在。吸收和脂肪壞死被認(rèn)為是由于移植脂肪周圍新生血管不足，從而導(dǎo)致脂肪細(xì)胞缺乏營養(yǎng)供給和代謝廢物的積累。為了提高脂肪存活率，許多研究者在SR Coleman(1998年)研究的基礎(chǔ)上，從脂肪的獲取、脂肪處理、脂肪移植過程等方面進(jìn)行了研究。但是，并沒有相關(guān)研究證明一種技術(shù)明顯優(yōu)于其他技術(shù)[4]。因此，近年來研究者更多的關(guān)注于一些促進(jìn)脂肪存活的策略?；诎踩?、高效、經(jīng)濟(jì)、易于實施并且不需要復(fù)雜的實驗室處理以及極小并發(fā)癥的原則，在脂肪移植過程中加入基質(zhì)血管成分細(xì)胞(stromal vascular fraction， SVF)、促血管生長因子[5]、胰島素、促紅細(xì)胞生成素、富血小板血漿(platelet-richplasma， PRP)等[6-9]。這些方法中，自體PRP被廣泛應(yīng)用于外科治療中，如軟骨組織的創(chuàng)傷修復(fù)、創(chuàng)面愈合、整形外科等[10-11]。PRP對脂肪移植物存活的作用成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點，筆者現(xiàn)將相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展綜述如下。

2 PRP概述

PRP是由全血離心獲得的濃縮物。用來分離PRP的血液樣本應(yīng)該在手術(shù)開始時采集，因為手術(shù)創(chuàng)傷會使血小板聚集，啟動凝血過程，從而減少循環(huán)血小板數(shù)量[12]。血小板參與凝血過程，但同時也有促進(jìn)細(xì)胞增殖、趨化、血管再生、細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)合成的功能，這一切都對組織再生具有潛在作用，間接表明了其在增加自體脂肪移植存活中的作用。PRP中的血小板被激活后，α顆粒可釋放多種生長因子，作用于細(xì)胞膜，激活細(xì)胞內(nèi)蛋白通路，啟動酪氨酸激酶磷酸化并激活特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)入細(xì)胞核，表達(dá)特定的基因[13]。有研究表明，這些生長因子通過相互協(xié)同作用，可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的分裂和增殖以及移植脂肪的血管化。PRP能促進(jìn)和提高脂肪移植的成活率，其主要機(jī)制在于：⑴移植脂肪的血管化。PRP中的血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等都可以促進(jìn)移植脂肪新生血管的形成，使移植脂肪早期血管化，減少了移植脂肪的缺血性壞死和繼發(fā)性脂肪液化與吸收的發(fā)生。⑵促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化。細(xì)胞的分裂增殖離不開生長因子，血小板激活時，通過α顆粒的胞吐作用釋放大量生長因子，其中血小板源性生長因子、β轉(zhuǎn)化生長因子可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞的活性及數(shù)量。大多數(shù)的分析研究表明，應(yīng)用合適濃度的PRP與脂肪組織共同移植，其效果優(yōu)于對照組(單純脂肪移植)。

3 研究證據(jù)

3.1 動物實驗研究證據(jù) 近年來，大量基礎(chǔ)研究證實，激活的PRP應(yīng)用于脂肪移植能促進(jìn)血管新生,減輕炎癥反應(yīng)程度，提高脂肪細(xì)胞的成活率。Nakamura等[14]通過大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在120 d實驗觀察期間，添加PRP的實驗組在組織學(xué)鏡下可發(fā)現(xiàn)新增的肉芽組織和毛細(xì)血管形成，表明PRP能有效刺激血管新生；Seyhan等[15]的大鼠模型研究也發(fā)現(xiàn)，PRP可提高脂肪移植的成活率；另一項研究以新西蘭兔為模型，將PRP與自體脂肪以1∶1比例移植，在第8周和第12周觀察到，PRP組較對照組表現(xiàn)為較輕的炎癥反應(yīng)和更少的油脂和囊腫形成，而在纖維化、血管生成、脂肪體積方面沒有發(fā)現(xiàn)差異[16]。Choi等[17]以兔為研究對象，將脂肪組織與PRP等體積混合移植到皮下，結(jié)果顯示PRP組存活脂肪細(xì)胞數(shù)和新生血管數(shù)均高于對照組，同時壞死和炎癥反應(yīng)面積均較對照組小。劉景蘭等[18]用裸鼠模型研究PRP聯(lián)合脂肪干細(xì)胞對顆粒脂肪移植血運重建的影響，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合組較其他對照組微血管數(shù)量多，且血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34陽性表達(dá)率較其余各組明顯升高，脂肪細(xì)胞形態(tài)良好，呈葉狀，纖維結(jié)締組織少，可見血運重建對移植脂肪成活的重要性。

3.2 臨床應(yīng)用研究證據(jù) PRP用于乳房自體脂肪移植，Salgarello等[19]將10%PRP和自體脂肪聯(lián)合移植隆乳(17例)與自體脂肪單獨移植隆乳(25例)的效果進(jìn)行了比較，利用超聲影像進(jìn)行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組在脂肪液化壞死方面的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，陰性結(jié)果可能與樣本量較小、僅用簡單的評分體系評價有關(guān)。2012年，Gentile等[20]進(jìn)行了一項自體脂肪移植用于乳房再造的對比研究，1年后隨訪發(fā)現(xiàn)，PRP和脂肪組、SVF和脂肪組、對照組的移植脂肪體積保留率分別為63%、69%、39%。2013年，F(xiàn)iaschetti等[21]做了進(jìn)一步研究，為了更客觀的評價脂肪成活率，引用超聲、核磁和乳腺X線，發(fā)現(xiàn)術(shù)后6個月平均吸收率是15.36%，12個月是28.23%。2013年，Cervelli等[22]研究了不同濃度PRP的移植脂肪成活率，結(jié)果表明，PRP濃度與移植脂肪成活率呈正相關(guān)關(guān)系。

4 PRP提高脂肪移植成活率的可能機(jī)制

移植的自體脂肪顆粒早期通過營養(yǎng)物質(zhì)的離子擴(kuò)散，并從周圍組織供應(yīng)氧氣，直到移植組織的血運重新建立。大量的基礎(chǔ)實驗和臨床應(yīng)用已經(jīng)證實，移植的自體脂肪顆粒組織可以通過組織間的滲透供養(yǎng)直至血運重建而成活下來，血管是從周邊向中心生長，增多的血管成為脂肪移植后供血的主要渠道，說明了移植區(qū)血運的重建是脂肪移植成活的關(guān)鍵。 Kato等[23]認(rèn)為,移植后的脂肪組織按照存活情況可分為：最外層 (存活區(qū), surviving zone)、中間區(qū)域 (再生區(qū), regenerating zone)、最中心層(壞死區(qū), necrotic zone)。在早期缺血、缺氧的環(huán)境下， 僅最外層的脂肪細(xì)胞能夠存活， 內(nèi)部的脂肪細(xì)胞因缺少供血供氧不能存活。中間區(qū)域能耐受缺血缺氧的ADSCs和前脂肪細(xì)胞部分能存活， 進(jìn)而分化為成熟脂肪細(xì)胞；最中心層的細(xì)胞最不易存活，最終將被吸收或被纖維結(jié)締組織取代。

4.1 PRP促進(jìn)早期血管化 脂肪移植后，早期能否建立充足的血供對移植脂肪的成活至關(guān)重要。移植的脂肪對缺血再灌注損傷所發(fā)生的損害非常敏感，因此保留脂肪小葉的移植脂肪組織在短時間內(nèi)可重新建立血液供應(yīng)，進(jìn)而降低移植脂肪的吸收率。脂肪組織是被認(rèn)為是一個內(nèi)分泌器官，能在全身水平分泌一些脂肪因子，如瘦素和內(nèi)臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑。這表明脂肪顆粒能促進(jìn)早期建立脂肪移植后的血供[24]。PRP在激活后，可釋放對促進(jìn)血管新生有趨化作用的生長因子。有離體實驗研究表明，PRP中促進(jìn)血管新生的生長因子包括：間質(zhì)細(xì)胞衍生因子1、胰島素樣生長因子1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等[25]。同時，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和ADSCs能自分泌/旁分泌表達(dá)整合素αvβ3和PAI-1，參與到毛細(xì)血管再生過程中[26]。相關(guān)組織工程研究表明[27]，免疫熒光染色時胞核呈綠色的脂肪細(xì)胞和部分新生血管內(nèi)皮細(xì)胞是由外源性植入的脂肪干細(xì)胞分化而來；表明外源性植入的脂肪干細(xì)胞和內(nèi)源性的血管內(nèi)皮共同參與了新生脂肪組織的血管化過程；這種內(nèi)源性的內(nèi)皮細(xì)胞最有可能來自皮下組織的毛細(xì)血管網(wǎng)。由此可見，自體富血小板血漿能夠更好地促進(jìn)移植物種子細(xì)胞的血管化過程，加快移植物血運重建的速度，從而保證更多的種子細(xì)胞成活。4.2 PRP促進(jìn)ASDCs增殖分化 王喻[28]研究發(fā)現(xiàn)，PRP對ADSCs體外增殖的促進(jìn)作用可能與其對cyclinD1表達(dá)的上調(diào)作用有關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)，PRP也提高了CDK抑制劑p27Kip1的蛋白水平，提示PRP可能通過提高p27Kip1的蛋白水平抑制了ADSCs的過度增殖；有研究證實，脂肪移植過程中富含新鮮分離的基質(zhì)血管成分，混合的細(xì)胞群中包含小部分脂肪干細(xì)胞[29]；脂肪組織中含有的脂肪來源干細(xì)胞有分化成多種細(xì)胞譜系的潛能，包括脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和其他類型的細(xì)胞[30-31]；同時，脂肪干細(xì)胞可通過分泌生長因子促進(jìn)血管新生，這有利于移植脂肪的存活。PRP中的轉(zhuǎn)化生長因子可以誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，同時PRP誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞中可檢測到成脂相關(guān)基因過氧化物酶體激活受體γ及脂蛋白脂肪酶表達(dá)升高，說明富血小板血漿可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的成脂分化[32]；Liu等[33]研究發(fā)現(xiàn)，PRP能正調(diào)節(jié)成骨過程，而負(fù)調(diào)節(jié)前脂細(xì)胞轉(zhuǎn)換為脂肪細(xì)胞的過程(3T3-L1細(xì)胞株)。同時也發(fā)現(xiàn)，PRP能通過增加成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)(如RunxII、OPN、OCN等)，減少脂肪細(xì)胞特異性基因(如PPAR-r)的表達(dá)，從而使脂肪細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化；Gentile等[20]通過PRP和重組人胰島素對離體人ADSCs的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可通過絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt蛋白依賴機(jī)制的通路，誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，從而促進(jìn)脂肪細(xì)胞的存活；Gentile等[34]研究了不同濃度的PRP對離體ADSCs的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRP濃度在0.2～0.4 ml時，其對ADSCs的增殖作用隨濃度增加而增強(qiáng)，更高濃度的PRP沒有進(jìn)一步地促進(jìn)作用；另一個離體實驗[35]表明，PRP有促進(jìn)ADSCs增殖的作用，PRP有望取代胎牛血清成為更有前景的培養(yǎng)基成分。10 d培養(yǎng)的研究結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的胎牛血清相比，合適濃度的nPRP(未激活PRP)和tPRP(凝血酶激活PRP)均優(yōu)于傳統(tǒng)胎牛血清，具有統(tǒng)計學(xué)意義；有研究者推測，nPRP中的未激活的血小板逐漸活化并釋放生長因子(而不是tPRP中生長因子短時間釋放)可以模擬生理情況的血小板活化過程[36]。4.3 PRP調(diào)節(jié)炎癥因子和腫脹過程 除了在炎癥反應(yīng)和組織愈合過程中產(chǎn)生一系列炎癥趨化因子，血小板也表達(dá)趨化因子(如CCR1、CCR3、CCR4和CXCR4)。它們參與到炎癥應(yīng)答過程中，通過抗炎性細(xì)胞因子(如TGF-β)防止過多的白細(xì)胞聚集。在離體實驗中，證實PRP抑制炎癥通路中的酶反應(yīng)(如環(huán)氧化酶1(COX-1)、環(huán)氧化酶2(COX-2)和膜結(jié)合型前列素E合成酶(mPGES)。環(huán)氧化酶(特別是環(huán)氧化酶2)是主要的炎癥因子[37]。環(huán)氧化酶是髓過氧化物酶，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上，在多種組織中都表達(dá)。此外，高濃度的前列腺素E2(PGE2)不僅加劇炎癥反應(yīng)，也會抑制細(xì)胞分裂。在體內(nèi)實驗中，注射PRP可減少PGE2，并降低d-COX-1,COX-2,和mPGES的表達(dá)。這表明PRP可能有抗炎的作用[38-39]。4.4 PRP提高分化前脂肪細(xì)胞的抗凋亡活性 Fukaya等[40]定義了來源于脂肪組織的分化前脂肪細(xì)胞。其研究發(fā)現(xiàn)，2%PRP+2%FBS與2%PPP相比，能更強(qiáng)地抑制血清缺乏以及TNF-α/放線菌酮相關(guān)的凋亡過程。研究者還發(fā)現(xiàn)，在2%PRP培養(yǎng)基中，DAPK1和BIM(Bcl-2-interacting mediator)mRNA基因表達(dá)較其余兩組減少5%～10%。結(jié)果表明，前脂肪細(xì)胞的抗凋亡活性與DAPK1和BIM基因的表達(dá)相關(guān)；也有文獻(xiàn)報道，富小板血漿激活后形成豐富的纖維網(wǎng)絡(luò)對促進(jìn)細(xì)胞黏附,防止細(xì)胞流失具有一定作用[41]，也對降低脂肪移植的吸收起到積極作用。

5 前景展望

基于上述文獻(xiàn)，我們可知，PRP脂肪移植的主要貢獻(xiàn)包括限制炎癥和改善組織愈合與再生。同時，在脂肪細(xì)胞分化和血管生成的過程中起重要作用。這些因素可能起協(xié)同作用，促進(jìn)脂肪再生。將自體富血小板血漿與脂肪干細(xì)胞植入體內(nèi)，構(gòu)建組織工程化脂肪，證實是可行的；雖然PRP提高移植脂肪存活率在臨床應(yīng)用上取得了顯著的效果[42-43]，但支持PRP和脂肪移植應(yīng)用于軟組織修復(fù)的證據(jù)仍然有限，只有一些基礎(chǔ)研究和動物實驗[44]，仍然缺乏大樣本、多中心的臨床循證醫(yī)學(xué)證據(jù)；而且，進(jìn)一步的分子機(jī)制和蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究， PRP參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的信號通路等問題，是今后的研究方向；在PRP的制備和應(yīng)用過程中，仍然缺乏規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)；PRP與脂肪的濃度比，最佳的激活物和激活方式，PRP的制備是否需要個體化，脂肪存活率的客觀量化指標(biāo)，采用更為客觀的3d-MD、CT和 MRI評價技術(shù)取代主觀的評分[45]等問題仍需要進(jìn)一步研究。

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100144 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院 整形十五科

譚流暢(1990-)，女，重慶人，住院醫(yī)師，碩士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.02.014

2015-11-28)