刺參溫度相關(guān)基因在模擬不同海域冬春季水溫條件下的表達(dá)研究

刺參溫度相關(guān)基因在模擬不同海域冬春季水溫條件下的表達(dá)研究

白雪秋，丁君，曹學(xué)順，李成澤，常亞青

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

摘要:為探討不同海域冬春季水溫對刺參溫度相關(guān)基因的表達(dá)影響，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬了俄羅斯沿海地區(qū)、大連沿海地區(qū)、福建沿海地區(qū)12月至翌年4月刺參Apostichopus japonicus生長的海水溫度,并從已構(gòu)建的刺參耐寒基因篩選cDNA文庫和刺參高溫脅迫正反消減cDNA文庫中選取了7個(gè)差異基因:hsp70、gp96、UQCRFS1、ferritin、lysozyme、mtLSU、proeintl(2)efl，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了這7個(gè)基因在3種海域冬春季模擬水溫條件下的表達(dá)情況。結(jié)果表明：3個(gè)水溫組刺參同一組織中hsp70基因的表達(dá)量變化不明顯，但在不同組織中的表達(dá)量存在差異；模擬福建沿海地區(qū)冬春季水溫組刺參各組織中g(shù)p96基因的表達(dá)量整體上均高于其他兩個(gè)水溫組，并且在模擬福建沿海地區(qū)冬春季水溫組刺參呼吸樹中的表達(dá)量顯著高于該組腸和體壁(P<0.05)；模擬俄羅斯沿海地區(qū)冬春季水溫組刺參各組織中UQCRFS1基因的表達(dá)量均高于其他兩個(gè)水溫組；3個(gè)水溫組刺參各組織中ferritin基因的表達(dá)模式及表達(dá)量均不相同；3個(gè)水溫組刺參各組織中l(wèi)ysozyme和proeintl(2)efl兩個(gè)基因的表達(dá)量均在呼吸樹中達(dá)到最高，且顯著高于腸和體壁(P<0.05)；3個(gè)水溫組刺參各組織中mtLSU基因的表達(dá)模式基本相同，其表達(dá)量均表現(xiàn)為體壁顯著高于腸和呼吸樹(P<0.05)。

關(guān)鍵詞:刺參；溫度；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；功能基因；差異表達(dá)

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.01.004

文章編號：2095-1388(2015)01-0018-07

中圖分類號：S917.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2014-05-17

基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(LTQ2011073); 遼寧省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(2011203003); 國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201105016-3)

作者簡介：白雪秋(1988—), 女, 碩士研究生。E-mail:baixue135qiu@sina.cn

Abstract：The genes related to temperature including hsp70, gp96, UQCRFS1, ferritin, lysozyme, mtLSU, and proeintl(2)efl selected from the subtracted cDNA library were expressed in body wall, intestine and respiratory tree of sea cucumber Apostichopus japonicas using quantitative Real-time PCR under the simulated sea water temperature in Russian coastal area, Dalian coastal area, and Fujian coastal area from December to April in a laboratory. The expression of hsp70 gene was found to be not significant difference in the same tissue in the three temperature groups, but there was significant differences in different tissues at the same conditions. There was higher expression of gp96 gene in the simulation of Fujian coastal area in winter and spring group than in the other two groups, significantly higher relative expression levels in respiratory tree than in intestine and the body wall in the simulation of Fujian coastal area in winter and spring group (P<0.05). The expression of UQCRFS1 gene was higher in the simulation of Russian coastal area in winter and spring groups than in the other two groups. No same ferritin gene expression patterns and relative expression levels was observed in the three temperature groups. The maximal relative expression levels of both lysozyme and proeintl (2)efl genes were found in the respiratory tree, significantly higher than in the intestine and body wall in the three groups (P<0.05). There were essentially the same mtLSU gene expression patterns in the three groups, significantly higher relative expression levels in the body wall than that in the intestine and respiratory tree (P<0.05).

刺參Apostichopusjaponicus(Selenka)是亞洲海岸廣泛分布的淺海底棲物種，棲息于潮間帶至水深20~30 m的淺海，主要分布于35°N到44°N的西北太平洋沿岸，自然分布區(qū)北起俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，經(jīng)朝鮮、韓國、日本,南至中國北部[1-2]。刺參可以在0~30 ℃的水溫范圍內(nèi)生存，但刺參的生長水溫為12~21 ℃，幼參生長的最適水溫為15~18 ℃，水溫是影響刺參生長和生理活動(dòng)的重要因子之一,水溫大于24 ℃時(shí)刺參開始進(jìn)入夏眠階段[3]。

刺參是一種高蛋白、低脂肪的經(jīng)濟(jì)物種,其巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值推進(jìn)了該物種養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展以及養(yǎng)殖地域由北方向南方的拓展。福建省沿海地區(qū)利用冬春季水溫(10~20 ℃)適合刺參生長的優(yōu)勢，從遼寧等地引進(jìn)刺參開始了中國南方的刺參養(yǎng)殖。2011年福建地區(qū)刺參的總產(chǎn)量達(dá)到8532 t，為中國南方刺參養(yǎng)殖的主要地區(qū)。2011年遼寧地區(qū)刺參總產(chǎn)量為5.49萬t，占中國刺參總產(chǎn)量的39.89%[4]，為刺參產(chǎn)量的主要產(chǎn)區(qū)，并且中國眾多海參中以分布在北方沿海(主要為遼東半島)的刺參營養(yǎng)價(jià)值最高且藥用價(jià)值最廣泛。俄羅斯遠(yuǎn)東海域?yàn)榇虆B(yǎng)殖的最北部，所產(chǎn)刺參的肉刺多為6排、體壁厚度大且營養(yǎng)價(jià)值高[1]。目前,有關(guān)刺參養(yǎng)殖環(huán)境方面的研究主要集中在一個(gè)地區(qū)的溫度、溶氧、鹽度、pH等環(huán)境因子對刺參的影響，或者是高低溫以及鹽度脅迫對刺參功能基因的影響[5-9]。于姍姍等[7]研究了夏季暴雨引起養(yǎng)殖池塘鹽度變化對仿刺參的影響,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬野外鹽度變化，研究了hsp70、hsp90a和hsp90b基因的表達(dá)。李成澤等[8]研究了在溫度脅迫下刺參組織中MYP1和MYP2基因的表達(dá)情況。楊愛馥等[9]研究了幼參注射LPS前后其4種組織中ferritin基因的表達(dá)量。但尚未見不同地區(qū)水溫對刺參功能基因影響方面的報(bào)道，本研究中，借助已構(gòu)建的刺參耐寒基因篩選cDNA文庫和刺參高溫脅迫正反消減cDNA文庫中的7個(gè)差異基因：熱休克蛋白70基因(hsp70)、熱休克蛋白gp96基因(gp96)、cytochrome b-c1 complex subunit rieske基因(UQCRFS1)、鐵蛋白基因(ferritin)、溶菌酶基因(lysozyme)、線粒體核糖體大亞基RNA 基因(mitochondrial large subunit ribosomal RNA,mtLSU)、致死必需蛋白基因(protein lethal(2)essential for life,proeintl(2)efl)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了模擬3種海域冬春季水溫條件下這7個(gè)基因在刺參各組織中表達(dá)水平的變化，以期為刺參南移養(yǎng)殖提供新的資料。

通信作者： 丁君(1973—), 女, 研究員。E-mail:dingjun1119@dlou.edu.cn

1材料與方法

1.1　材料

試驗(yàn)用刺參為農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育的1齡刺參。從中隨機(jī)選取120頭個(gè)體活潑、大小相近的刺參，體長為(78.4±2.1)mm，體寬為(19.1±0.5)mm，濕體質(zhì)量為(18.8±1.1)g。

1.2　方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)將120頭刺參分成3組，每組40頭，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室控溫水槽中。3個(gè)水溫組分別模擬俄羅斯沿海地區(qū)、大連沿海地區(qū)、福建沿海地區(qū)2012年12月至翌年4月刺參生長環(huán)境溫度(表1)，其中R組為模擬俄羅斯沿海地區(qū)冬春季水溫組(簡稱為俄羅斯水溫組)，D組為模擬大連沿海地區(qū)冬春季水溫組(簡稱為大連水溫組)，F(xiàn)組為模擬福建沿海地區(qū)冬春季水溫組(簡稱為福建水溫組)。3個(gè)水溫組的養(yǎng)殖條件除溫度不同外其他條件均相同。

試驗(yàn)從2012年11月29日開始，將3組刺參放入3個(gè)水溫組的水槽中，按照表1中各海域每月的海水溫度嚴(yán)格控制水溫，經(jīng)過151 d的養(yǎng)殖，至2013年4月30日試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從每組取3頭刺參，將刺參解剖后分別取適量體壁、腸、呼吸樹組織于1.5 mL RNase free離心管中，凍存于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2總RNA的提取取凍存的組織10~20 mg，用RNA試劑盒(天根生化科技有限公司)提取總RNA，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用NV3000 Sepctrophotometer檢測RNA的純度及濃度，將完整性、濃度與純度符合試驗(yàn)要求的RNA溶液凍存于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

表13個(gè)沿海地域冬春季的海水溫度

Tab.1Sea water temperature at the three coastal areas in winter and spring

℃

1.2.3cDNA的制備用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa公司)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系(共20 μL)：5 × PrimeScriptTMbuffer 4 μL, PrimeScriptTMRT enzyme Mix I 1 μL, Oligo dT Primer 1 μL, Random 6 mers 1 μL, Total RNA 500 ng, 用RNase Free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。樣品混勻后在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件為37 ℃下反應(yīng)15 min, 85 ℃下反應(yīng)5 s。

1.2.4引物設(shè)計(jì)及篩選使用Primer Premier 5.0軟件對每個(gè)基因設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,并檢測引物的特異性及擴(kuò)增效率。引物序列信息見表2，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.5Real-time PCR以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit (Tli RNaseH Plus, TaKaRa公司)試劑盒，在Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System(Life Technologies, USA) 上進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系(共20 μL)：2 × SYBR Premix ExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)10 μL, ROX Reference Dye II 0.4 μL, cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.4 μL, 用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性30 s,95 ℃下變性5 s, 60 ℃下退火32 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；溶解曲線階段95 ℃下變性30 s, 60 ℃下退火1 min, 95 ℃下延伸15 s。

1.3　數(shù)據(jù)處理

以cytb為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，所得結(jié)果用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在單因素ANOVA方差分析達(dá)到顯著水平(P<0.05)時(shí)，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

表2　實(shí)時(shí)定量PCR引物信息

2結(jié)果與分析

2.1　RNA的提取

將提取的RNA進(jìn)行完整性檢測，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測分析，部分結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，樣品電泳后所得到的28 S、18 S條帶清晰,且28 S條帶的亮度明顯高于18 S。說明提取的RNA完整性良好,符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

注：M為DL2000 Marker;1~3為腸組織樣品；4~6為體壁組織樣品；7~9為呼吸樹組織樣品 Note:M，DL2000 Marker; 1-3,RNA of sample in intestine; 4-6,RNA of sample in body wall; 7-9,RNA of sample in respiratory tree 圖1　刺參部分組織RNA的瓊脂糖電泳圖 Fig.1　Agarose gel electrophoresis in several tissues of sea cucumber Apostichopus japonicus

2.2　引物篩選結(jié)果

cytb基因和7個(gè)刺參溫度相關(guān)基因所得溶解曲線的熔點(diǎn)峰窄且尖，為單峰，說明其特異性好，所設(shè)計(jì)的引物可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

2.3　溫度相關(guān)基因在刺參組織中的表達(dá)

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測3個(gè)水溫組刺參腸、呼吸樹、體壁組織中各基因的表達(dá)量，結(jié)果使用SPSS 19.0進(jìn)行均一化處理，其中以大連水溫組刺參腸組織中溫度相關(guān)基因的表達(dá)量作基準(zhǔn)為1，取平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤，使用OriginPro 8軟件作柱狀圖進(jìn)行分析。

2.3.1hsp70和gp96基因從圖2可見：3個(gè)水溫組刺參各組織中hsp70和gp96基因的表達(dá)量均在呼吸樹中達(dá)到最高；同一水溫組刺參各組織中hsp70基因的表達(dá)量有差異且部分顯著(P<0.05)，不同水溫組刺參同一組織中hsp70基因的表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)；福建水溫組刺參呼吸樹中g(shù)p96基因的表達(dá)量顯著高于該組的腸和體壁(P<0.05)，也顯著高于其他兩個(gè)水溫組刺參呼吸樹中的表達(dá)量(P<0.05)，俄羅斯和大連兩個(gè)水溫組刺參各組織中的表達(dá)量均無顯著性差異(P>0.05)，福建水溫組刺參各組織中g(shù)p96基因的表達(dá)量整體上均高于其他兩個(gè)水溫組。

注：標(biāo)有不同大寫字母者表示不同水溫組相同組織間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有不同小寫字母者表示同一水溫組不同組織間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同 Note:The means with different capital letters in the same tissues within different temperature groups are significantly different at the 0.05 probability level, with different letters in the different tissues within the group being significantly different at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia 圖2　hsp70和gp96基因在刺參不同組織中的表達(dá) Fig.2　Relative expression of hsp70 and gp96 genes in different tissues of sea cucumber Apostichopus japonicus

2.3.2UQCRFS1基因從圖3可見：3個(gè)水溫組刺參各組織中UQCRFS1基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)出呼吸樹中最高，且顯著高于腸和體壁(P<0.05)；俄羅斯水溫組呼吸樹中的表達(dá)量(25.72)約為腸中表達(dá)量(9.92)的3倍、體壁中表達(dá)量(4.33)的6倍，且俄羅斯水溫組刺參各組織中的表達(dá)量均高于其余兩個(gè)水溫組；3個(gè)水溫組腸組織間的表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05)，俄羅斯水溫組刺參呼吸樹中的表達(dá)量顯著高于其他兩個(gè)水溫組(P<0.05)，俄羅斯水溫組刺參體壁中的表達(dá)量顯著高于大連水溫組(P<0.05)。

圖3　UQCRFS1基因在刺參不同組織中的表達(dá) Fig.3　Relative expression of UQCRFS1 gene in different tissues of sea cucumber Apostichopus japonicus

2.3.3ferritin基因從圖4可見：俄羅斯水溫組刺參各組織中ferritin基因的表達(dá)量均有顯著性差異(P<0.05)，而大連水溫組刺參各組織間的表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)；3個(gè)水溫組中，俄羅斯水溫組刺參體壁中的表達(dá)量顯著高于其他兩個(gè)水溫組(P<0.05)，福建水溫組刺參腸中的表達(dá)量顯著高于俄羅斯水溫組(P<0.05)，福建水溫組刺參呼吸樹中的表達(dá)量顯著高于大連水溫組(P<0.05)。

2.3.4lysozyme基因從圖5可見：3個(gè)水溫組刺參各組織中l(wèi)ysozyme基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)出呼吸樹中最高，且顯著高于腸和體壁(P<0.05)；福建水溫組刺參各組織中的表達(dá)量均高于大連水溫組；隨著整體水溫的升高，刺參腸中的表達(dá)量逐漸增加；俄羅斯水溫組刺參呼吸樹中的表達(dá)量顯著高于其他兩個(gè)水溫組(P<0.05)。

圖4　ferritin基因在刺參不同組織中的表達(dá) Fig.4　Relative expression of ferritin gene in different tissues of sea cucumber Apostichopus japonicus

圖5　lysozeme基因在刺參不同組織中的表達(dá) Fig.5　Relative expression of lysozeme gene in different tissues of sea cucumber Apostichopus japonicus

2.3.5mtLSU基因從圖6可見：3個(gè)水溫組刺參各組織中mtLSU基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)出體壁中最高，且顯著高于腸和呼吸樹(P<0.05)，而腸與呼吸樹中的表達(dá)量則無顯著性差異(P>0.05)；3個(gè)水溫組中，俄羅斯水溫組和福建水溫組刺參體壁中的表達(dá)量比大連水溫組刺參體壁中略高(P>0.05)。

圖6　mtLSU基因在刺參不同組織中的表達(dá) Fig.6　Relative expression of mtLS gene in different tissues of sea cucumber Apostichopus japonicus

2.3.6proeintl(2)efl基因從圖7可見：俄羅斯和福建水溫組刺參各組織中proeintl(2)efl基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)出呼吸樹中最高，且顯著高于腸和體壁(P<0.05)，而大連水溫組刺參也呈現(xiàn)出呼吸樹中最高，但僅顯著高于體壁(P<0.05)；3個(gè)水溫組中，俄羅斯水溫組刺參體壁中的表達(dá)量顯著高于其他兩個(gè)水溫組(P<0.05)。

圖7　proeintl(2)efl基因在刺參不同組織中的表達(dá) Fig.7　Relative expression of proeintl(2)efl gene in different tissues of sea cucumber Apostichopus japonicus

3討論

3.1　水溫對 hsp70、 gp96和 proeintl(2) efl基因表達(dá)的影響

熱休克蛋白HSP70和GP96作為分子伴侶參與免疫相關(guān)活動(dòng)。相關(guān)研究表明，當(dāng)生物體處于環(huán)境脅迫狀態(tài)時(shí),機(jī)體通過提高HSPs的表達(dá)量來增強(qiáng)機(jī)體的應(yīng)激耐受性，以減少機(jī)體在應(yīng)激過程中所受的傷害。hsp70基因的表達(dá)量與溫度刺激時(shí)間長短有關(guān)，不同溫度刺激前后刺參組織樣品中hsp70的表達(dá)量變化差異很明顯[10-12]。Dong等[10]證明了刺參hsp70的表達(dá)量受高溫脅迫的影響。吉成龍等[13]報(bào)道，高溫(28 ℃)誘導(dǎo)刺參使其體壁中hsp70 的表達(dá)量增加。Ji等[5]證實(shí)了當(dāng)環(huán)境溫度保持在26 ℃時(shí)，hsp70的表達(dá)水平為先增加后降低。本研究中每個(gè)月的溫度控制是恒定的，結(jié)果顯示，hsp70在不同水溫組刺參同一組織中的表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)，由此可推測，恒定溫度的累積作用對hsp70在刺參組織中表達(dá)的影響不明顯，但在同一水溫組刺參各組織中的表達(dá)量有差異且部分顯著(P<0.05)，說明hsp70基因在刺參中具有明顯的組織差異性。

GP96參與細(xì)胞的熱耐受過程，對細(xì)胞的生長、發(fā)育具有一定的調(diào)節(jié)作用[14]。本研究中，gp96基因在3個(gè)水溫組刺參組織中的表達(dá)量均為呼吸樹中最高，并且福建水溫組刺參各組織中的表達(dá)量整體上均高于其他兩組。推測gp96在相對較高的水溫條件下更容易參與免疫調(diào)節(jié)過程，且在刺參呼吸樹中最為明顯。

致死必需蛋白的氨基酸序列與已知果蠅的小熱休克蛋白高度相似。在果蠅胚胎發(fā)育與幼體階段，proeintl(2)efl基因一直都有表達(dá)，這與小熱休克蛋白的功能很相似[15]。孫國華等[6]發(fā)現(xiàn)，高溫刺激刺參后該基因的表達(dá)量增加，并推測該基因?qū)儆诖虆⑿嵝菘说鞍?。但與同為熱休克蛋白家族的hsp70和gp96兩個(gè)基因相比，其表達(dá)趨勢既有相同之處又有其自身特性。本研究中，在3個(gè)水溫組中，gp96基因在呼吸樹中的表達(dá)量均顯著高于腸和體壁(P<0.05)，存在組織差異性。但在不同水溫組刺參腸和呼吸樹中的表達(dá)量變化不明顯，而在體壁中的表達(dá)量變化顯著(P<0.05)，這可能與體壁最先接觸到環(huán)境溫度有關(guān)。

3.2　水溫對 UQCRFS1基因表達(dá)的影響

UQCRFS1蛋白是線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ中的一個(gè)亞單位，對線粒體呼吸鏈的電子傳遞起著重要作用。呼吸鏈?zhǔn)切柩跎铽@取和儲(chǔ)存能量的關(guān)鍵，呼吸鏈位于線粒體內(nèi)膜，而線粒體一般分布在細(xì)胞功能旺盛的區(qū)域，以及心肌細(xì)胞、腎臟細(xì)胞等大量耗能細(xì)胞中[16]。張婷等[17]發(fā)現(xiàn)，UQCRFS1基因在大鼠的心臟組織中表達(dá)量較高，在腦和肺組織中表達(dá)量稍低。本試驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)，在俄羅斯水溫組刺參各組織中UQCRFS1基因的表達(dá)量均高于其他兩個(gè)水溫組，且在3個(gè)水溫組刺參呼吸樹中的表達(dá)量顯著高于腸和體壁 (P<0.05)，推測在相對較低的水溫條件下刺參呼吸樹中的能量消耗相對較大。

3.3　水溫對 ferritin基因表達(dá)的影響

Ferritin具有調(diào)節(jié)代謝平衡、抗氧化等功能。Ferritin是主要的貯鐵庫，而鐵屬于微量元素，與動(dòng)物的攜氧、產(chǎn)能等過程密切相關(guān)。從本試驗(yàn)結(jié)果中可知，ferritin基因在刺參腸、呼吸樹、體壁組織中均有表達(dá)。在其他水生動(dòng)物中，ferritin基因在不同組織中也均有表達(dá)，如在凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei的肌肉、鰓、眼柄和心臟中ferritin基因均有表達(dá)，且在血淋巴中表達(dá)量最高[18]；在合浦珠母貝Pinctadafucata的外套膜、鰓、消化道和肌肉中ferritin基因都有表達(dá)，并且ferritin基因在外套膜、消化腺和肌肉中的表達(dá)較高[19]。本研究中，俄羅斯水溫組刺參各組織中ferritin的表達(dá)量差異顯著，且在體壁中的表達(dá)量最高。有研究表明，養(yǎng)殖環(huán)境的不同對鐵蛋白基因在刺參某些組織中的表達(dá)水平有影響，但在南方和北方養(yǎng)殖仿刺參呼吸樹中鐵蛋白基因的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異[20]。而福建水溫組刺參呼吸樹中ferritin的表達(dá)量卻顯著高于大連水溫組(P<0.05)，這可能與3個(gè)水溫組的養(yǎng)殖環(huán)境只有溫度不同有關(guān)，ferritin的表達(dá)模式可能受多種環(huán)境因素互相作用的影響。Giorgi等[21]在南極硬骨魚冷訓(xùn)化過程中發(fā)現(xiàn)，ferritin在低溫條件下最容易發(fā)揮作用。Yamashita等[22]發(fā)現(xiàn)，在虹鱒中，ferritin在免疫代謝和耐寒訓(xùn)練中發(fā)揮著雙重作用。本研究中，俄羅斯水溫組刺參體壁中ferritin基因的表達(dá)量最高，與上述觀點(diǎn)相符。

3.4　水溫對 lysozyme基因表達(dá)的影響

溶菌酶作為機(jī)體先天免疫系統(tǒng)中一個(gè)重要的效應(yīng)分子，參與多種免疫反應(yīng)。水產(chǎn)動(dòng)物中溶菌酶活性受溫度的影響。許友卿等[23]指出，溫度影響近江牡蠣i-型溶菌酶基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)其免疫功能。Pascoli等[24]在鱸Dicentrarchuslabrax中發(fā)現(xiàn)，在低溫條件下溶菌酶的活性很低。Li等[25]在冷刺激條件下，地中海貽貝Mediterraneanmussel和紫貽貝Mytilusgalloprovincialis血細(xì)胞中l(wèi)ysozyme基因表達(dá)量整體下降。Yu[26]指出，溫度變化會(huì)影響Mactraveneriformis的溶菌酶活性，且20 ℃時(shí)溶菌酶活性高于10 ℃。本研究中也發(fā)現(xiàn)，在福建水溫組刺參腸組織中l(wèi)ysozyme基因的表達(dá)量顯著高于其他兩個(gè)水溫組，福建水溫組刺參各組織中的表達(dá)量均高于大連水溫組，這可能是因?yàn)楦＝ㄋ疁亟M的水溫條件刺激機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)，使機(jī)體釋放更多的溶菌酶參與免疫調(diào)控。3個(gè)水溫組刺參各組織中l(wèi)ysozyme基因在刺參呼吸樹的表達(dá)量最高，并且俄羅斯水溫組刺參呼吸樹中的表達(dá)量顯著高于其他兩組，推測在俄羅斯水溫組刺參呼吸樹中l(wèi)ysozyme基因?qū)囟鹊拿舾谐潭认鄬^高。

3.5　水溫對 mtLSU基因表達(dá)的影響

本研究中，3個(gè)水溫組刺參體壁中mtLSU基因的表達(dá)量均最高，且顯著高于呼吸樹和腸中的表達(dá)量， 這與吉成龍等[13]的mtLSU基因在刺參體壁中的表達(dá)量高于縱肌、呼吸樹和消化道的結(jié)論基本一致。mtLSU基因在呼吸樹和腸中的表達(dá)量基本相等,這兩個(gè)組織均在刺參體腔內(nèi),推測該基因可能與刺參機(jī)體的能量代謝機(jī)制有關(guān)。mtLSU基因是刺參中新發(fā)現(xiàn)的基因，對其表達(dá)機(jī)制的研究較少，尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

本研究中所選的差異基因均為相對短暫的高低溫脅迫條件下刺參組織中表達(dá)差異的基因，而本試驗(yàn)中每個(gè)月溫度控制是恒定的，故在本試驗(yàn)條件下刺參各組織中有些差異基因的表達(dá)量無顯著性差異。這些基因的表達(dá)機(jī)制及其對刺參養(yǎng)殖和產(chǎn)量的影響還需進(jìn)一步探索。本研究結(jié)果有助于今后結(jié)合每種基因的組織表達(dá)差異性及其功能進(jìn)行針對性的研究，為提高刺參產(chǎn)量和擴(kuò)大養(yǎng)殖地域可提供基礎(chǔ)依據(jù)。

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Expression of genes related to temperature in sea cucumber

Apostichopusjaponicasunder the stimulated winter

and spring temperature in different coasts

BAI Xue-qiu, DING Jun, CAO Xue-shun, LI Cheng-ze, CHANG Ya-qing

(Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

Key words：Apostichopusjaponicus; temperature; Real-time fluorescent quantitative PCR; functional gene; differentially expressed