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      豬鏈球菌2型1910RR蛋白多克隆抗體的制備

      2016-01-12 08:48:00程堯田永祥劉澤文周丹娜段正贏楊克禮郭銳劉威袁芳艷
      湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年24期
      關(guān)鍵詞:豬鏈球菌克隆質(zhì)粒

      程堯 田永祥 劉澤文 周丹娜 段正贏 楊克禮 郭銳 劉威 袁芳艷

      摘要:通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)1910RR蛋白,并制備了多克隆抗體。結(jié)果表明,豬鏈球菌2型1910RR重組蛋白以上清形式表達(dá),Western-blot檢測(cè)證實(shí)了1910RR蛋白具有良好的免疫學(xué)活性,1910RR多克隆抗體效價(jià)為1∶4,為進(jìn)一步研究1910RR蛋白功能奠定了良好基礎(chǔ)。

      關(guān)鍵詞:豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2);1910RR蛋白; 原核表達(dá);多克隆抗體

      中圖分類號(hào):Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2015)24-6320-04

      DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.058

      Abstract: The polyclonal antibody of 1910RR protein of Streptococcus suis type 2 was expressed and prepared. The results showed that 1910RR protein was expressed in the supernatant and has good immunological activity. The polyclonal antibodies of rabbit anti 1910RR protein was 1∶4. The preparation of polyclonal antibody was successful and can be used for function research of 1910RR protein.

      Key words:Streptococcus suis type 2;1910RR protein;prokaryotic expression; polyclonal antibody

      豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)是一種重要的人畜共患病原菌,可引起豬的急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎等疾病,并可引起人類腦膜炎、敗血癥等,嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡[1,2]。1998年和2005年,江蘇省和四川省人流行感染SS2事件,患者出現(xiàn)中毒性休克綜合征[3],引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)SS2的廣泛關(guān)注與研究。

      SS2毒力因子種類很多,如莢膜多糖(Capsular polysaccha-ride,CPS)、溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-released protein,MRP)、胞外因子(Extracellular factor,EF)、溶血素(Suilysin,Sly)等[4,5]。由于不同菌株所具有的毒力因子各不相同,同一種毒力因子在不同菌株中的作用也不一定相同,同時(shí)單獨(dú)研究毒力因子的功能并不能深入解釋SS2的致病機(jī)制,因此研究這些毒力因子在SS2致病過程中是如何受調(diào)控并共同發(fā)揮作用將更為重要[6,7],廣泛存在于細(xì)菌中的二元調(diào)控系統(tǒng)(Two-component signal transduction system,TCSTS)作為調(diào)節(jié)自身功能和毒力的中樞系統(tǒng)而成為研究熱點(diǎn)。

      經(jīng)典的TCS由兩部分組成,組氨酸激酶(Histidine kinase,HK)和反應(yīng)調(diào)控因子(Response regulator,RR)。經(jīng)典的信號(hào)通路包括外界信號(hào)輸入、HK自體磷酸化、RR磷酸化及信號(hào)輸出[8]。1910HK/RR是豬鏈球菌2型的一對(duì)雙組分調(diào)控系統(tǒng),1910HK接受并傳遞外界信號(hào)刺激,反應(yīng)調(diào)控因子1910RR則負(fù)責(zé)調(diào)控下游目標(biāo)基因的表達(dá)或使目標(biāo)蛋白的功能發(fā)生變換。本試驗(yàn)克隆了豬鏈球菌2型1910rr基因,連接到原核表達(dá)載體pET-30a中,通過表達(dá)條件的摸索,成功獲得分泌性表達(dá)蛋白,制備了兔抗1910RR蛋白的多克隆抗體,為進(jìn)一步研究1910RR蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室實(shí)驗(yàn)室保存。Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/Hind Ⅲ及T4 DNA連接酶、E.coli DH5α、BL21(DE3)、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;六聯(lián)組氨酸純化鎳柱、山羊抗兔IgG、HRP-DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;日本大耳兔購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

      1.2 引物設(shè)計(jì)

      參照GenBank公布的豬鏈球菌2型05ZYH33的1910rr基因核苷酸序列,用Primer5設(shè)計(jì)一對(duì)引物:上游引物RrI:5′-CGCCGGATCCATGCATAAGATGTTAGTAGTTGAT-3′,下游引物RrII:5′-CGCCAAGCTTTCATTCTGTCTGTAATTGACCGAT-3′。在上、下游引物分別引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。

      1.3 1910rr基因的擴(kuò)增

      使用合成的引物RrI/RrII擴(kuò)增出1910rr基因后于1%瓊脂糖凝膠電泳分析,觀察其條帶大小是否符合預(yù)期。

      1.4 pET30a-1910rr原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

      1910rr基因與pET-30a經(jīng)BamHⅠ/Hind Ⅲ雙酶切處理后,以T4 DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化到E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,提取質(zhì)粒后BamHⅠ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定,陽性重組質(zhì)粒命名pET30a-1910rr,送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

      1.5 pET30a-1910RR融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

      將陽性重組質(zhì)粒pET30a-1910rr轉(zhuǎn)化宿主表達(dá)菌株BL21(DE3),挑取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含25 mg/L卡那霉素)中,37 ℃培養(yǎng)箱過夜,再按1∶100比例轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)1.5 h后加入終濃度為0.8 mmol/L 的IPTG,22 ℃誘導(dǎo)12~16 h。

      1.6 pET30a-1910RR融合蛋白的分離與純化

      上清的制備:誘導(dǎo)1 L陽性重組質(zhì)粒pET30a-1910rr轉(zhuǎn)化菌,10 000 r/min離心10 min收集菌體,用Buffer A重懸菌體,冰浴條件下超聲波破碎菌體(功率200 W,破碎1 s,停1 s)共破碎30次。裂解后菌液10 000 r/min離心30 min,收集上清。

      上清的純化:用平衡液平衡柱子后,將上清加入Ni-NTA Beads中, 充分結(jié)合后加入20 mmol/L咪唑洗滌雜蛋白, 最后用75 mmol/L咪唑洗脫液進(jìn)行洗脫,12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白純化情況。

      1.7 1910RR蛋白多克隆抗體的制備

      純化后的1910RR蛋白皮下多點(diǎn)免疫日本大耳兔,14 d免疫一次,首免前采血分離血清用于陰性對(duì)照。首免用弗氏完全佐劑,加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑。前兩次蛋白免疫量為6 mg/只,第3次和第4次免疫時(shí)劑量為12 mg/只。第4次免疫后7 d采血, 用瓊脂糖免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià),達(dá)到預(yù)期效果后,心臟采血后37 ℃靜置1 h,10 000 r/min離心15 min分離血清,-80 ℃保存。

      1.8 Western-blot鑒定重組蛋白免疫原性

      將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后將重組蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上,5%脫脂奶37 ℃封閉過夜。TBST洗滌3次,每次10 min,以3次免疫后的兔抗1910RR蛋白血清按1∶100稀釋作為一抗。37 ℃孵育1 h, TBST洗滌3次,每次10 min,1∶5 000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗,37 ℃作用1 h, TBST洗膜3次,DAB顯色液顯色至蛋白帶清晰,去離子水終止反應(yīng)。

      1.9 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)

      瓊脂平板打孔后,中間孔加入兔抗1910RR蛋白血清,周圍孔加入2倍倍比稀釋的重組蛋白,以此確定最佳抗原濃度;再將確定稀釋好的重組蛋白加入中間孔,周圍加入2倍倍比稀釋的兔抗1910RR蛋白血清,出現(xiàn)沉淀線的最大稀釋度即為抗體效價(jià)。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 1910rr基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

      使用合成的引物RrI/RrII擴(kuò)增1910rr基因。如圖1所示,PCR擴(kuò)增出1 200 bp左右的片段,與預(yù)期片段1 290 bp大小一致。

      2.2 重組表達(dá)載體的酶切鑒定

      如圖2所示,pET30a-1910rr重組表達(dá)載體經(jīng)BamHⅠ/Hind Ⅲ雙酶切后出現(xiàn)2條帶,分別在5 000 bp左右和1 200 bp左右,與預(yù)期的5 422 bp和1 290 bp條帶大小一致。陽性重組質(zhì)粒pET30a-1910rr經(jīng)北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序,1910rr基因序列完全正確且讀碼框無誤。

      2.3 pET30a-1910RR融合蛋白的表達(dá)與純化

      用0.8 mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)12~16 h后,轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pET30a-1910rr的BL21(DE3)均表達(dá)出56 ku的融合蛋白,而且誘導(dǎo)量無明顯差異。以上清形式表達(dá)的重組蛋白和六聯(lián)組氨酸鎳柱結(jié)合后用75 mmol/L咪唑濃度的洗脫液進(jìn)行洗脫。如圖3所示,上清純化前目的蛋白條帶很濃,而純化后的上清無目的蛋白條帶,說明目的蛋白與六聯(lián)組氨酸鎳柱的結(jié)合效果很好;洗脫液里出現(xiàn)明顯目的蛋白條帶,雜帶很少,得到較純凈的目的蛋白。

      2.4 Western-blot鑒定重組蛋白免疫原性

      將純化后的融合蛋白與重組蛋白免疫4次后的兔血清反應(yīng),Western-blot驗(yàn)證血清中多克隆抗體的存在。如圖4所示,Western-blot可以檢測(cè)到在56 ku處有一明顯條帶出現(xiàn),證實(shí)純化后的目的蛋白可被兔血清識(shí)別,多克隆抗體的制備是成功的。

      2.5 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)

      瓊脂平板打孔后,中間孔加入兔抗1910RR蛋白血清,周圍孔加入2倍倍比稀釋的重組蛋白,以此確定最佳抗原濃度為1.0 mg/mL。中間孔加1.0 mg/mL的1910RR蛋白,兔抗1910RR蛋白血清以2倍倍比稀釋,檢測(cè)結(jié)果兔抗1910RR蛋白血清效價(jià)為1∶4(圖5)。

      3 小結(jié)與討論

      豬鏈球菌2型SC19菌株雙組分1910HK/RR缺失后,在TSB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率明顯變慢,毒力顯著下降,與野生株相比有219個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化,其中105個(gè)基因下調(diào)表達(dá)1.5倍以上,114個(gè)基因上調(diào)1.5倍以上[8]。因此,本研究以豬鏈球菌2型1910RR蛋白為研究對(duì)象,通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬鏈球菌2型1910RR蛋白并制備了多克隆抗體,為進(jìn)一步研究1910RR蛋白功能奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

      原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白多以無活性的包涵體形式存在,包涵體主要是由于蛋白合成過快、過多、還來不及正確折疊和二硫健未能正確配對(duì),相互聚積而成[9]。包涵體蛋白大多沒有活性,需要變性復(fù)性,而且純化效果不好。通過降低IPTG濃度、轉(zhuǎn)速、溫度等條件,降低蛋白的合成速率,可以在一定程度上增加蛋白的可溶性表達(dá)[10]。以上清形式表達(dá)的可溶性融合蛋白的His殘基是暴露的,所以其更易與六聯(lián)組氨酸鎳柱結(jié)合,純化效果要比包涵體好,而且不需要變性復(fù)性。在本研究中,重組質(zhì)粒pET30a-1910rr轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株后,通過添加0.8 mmol/L的IPTG誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)pET30a-1910RR融合蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。通過蛋白表達(dá)溫度的摸索,獲得了在低溫(22 ℃)條件下以上清形式表達(dá)的pET30a-1910RR融合蛋白。

      Western-blot鑒定結(jié)果表明,制備的融合蛋白pET30a-1910RR抗血清可以與重組蛋白反應(yīng),檢測(cè)到血清中相應(yīng)的多克隆抗體,說明重組蛋白具有較好的免疫原性。但是存在一些雜帶,這在多克隆抗體的制備中是比較常見的,因?yàn)閼?yīng)用動(dòng)物免疫方法制備的多克隆抗體通常含有針對(duì)其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。

      本研究通過原核表達(dá)豬鏈球菌2型雙組分調(diào)控系統(tǒng)1910HK/RR反應(yīng)調(diào)控蛋白1910RR,免疫SPF日本大耳兔,制備了多克隆抗體,為運(yùn)用CHIP-Seq技術(shù)研究雙組分調(diào)控系統(tǒng)1910HK/RR與受調(diào)控基因的作用方式,并獲得與反應(yīng)調(diào)控因子1910RR蛋白結(jié)合的DNA序列及核心位點(diǎn)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

      參考文獻(xiàn):

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