湖北不同地區(qū)甘薯蔓割病病原菌的分離與分子鑒定

雷劍　王連軍　楊新筍　蘇文瑾　柴沙沙

摘要：2011～2014年分別從湖北省甘薯主產(chǎn)區(qū)十堰市、武漢市、宜昌市等地分別采集了甘薯蔓割病（Fusarium bulbigenum）發(fā)病典型植株，在實(shí)驗(yàn)室分離純化并培養(yǎng)，并對分離得到的真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果顯示目的片段長度為544 bp，武漢和宜昌的序列完全一致。從十堰擴(kuò)增出來的序列的385位置是C而武漢和宜昌擴(kuò)增的結(jié)果該位置是T，說明引起湖北省甘薯蔓割病的甘薯鐮孢菌存在多態(tài)性。

關(guān)鍵詞：甘薯；甘薯蔓割?。‵usarium bulbigenum）； 病原菌； 分離； 分子鑒定

中圖分類號(hào)：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）24-6235-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.034

Abstract： From the city of Shiyan， Wuhan， Yichang， 3 Fusarium bulbigenum pathogens were separated and purified. by Molecular identified F. bulbigenum from different regions of Hubei province. The test results showed that the length of the target fragment was 544 bp， and the sequence of Wuhan and Yichang was the same. From Shiyan amplified sequence of 385 position was C and Wuhan and Yichang amplification results of the location was T， molecular indicating that the F. bulbigenum from different regions of Hubei province presenced polymorphism.

Key words： sweetpotato； Fusarium bulbigenum； pathogenicity； isolation； molecular identification

甘薯具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)豐富、用途廣泛等特點(diǎn)，是中國僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物[1，2]。甘薯蔓割病又稱鐮刀菌枯萎?。‵usarium bulbigenum），是中國南方甘薯產(chǎn)區(qū)的一種主要真菌性病害，近年來有向長江中下游區(qū)域蔓延的趨勢，根據(jù)2011年以來湖北省甘薯主產(chǎn)區(qū)主要甘薯病害調(diào)查結(jié)果顯示，十堰市、武漢市、荊州市及宜昌市均發(fā)現(xiàn)了甘薯蔓割病的危害，部分田塊發(fā)病率高達(dá)30%以上。該病在田間隨機(jī)分布，一般減產(chǎn)10%～20%，重者達(dá)50%以上，對甘薯高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)威脅極大[3]。為此，本研究通過采集湖北省甘薯主產(chǎn)區(qū)十堰市、武漢市及宜昌市的蔓割病病樣，分離培養(yǎng)各地區(qū)采集的蔓割病病原菌樣本，鑒定各地區(qū)蔓割病病原菌的致病力差異，分析其表型及分子水平上的差異，為指導(dǎo)各地區(qū)蔓割病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蔓割病病原菌為2011～2014年間在湖北省甘薯主產(chǎn)區(qū)十堰市、武漢市、宜昌市等地分離純化得到的蔓割病病原菌菌株，依次命名為SY菌株、WH菌株及YC菌株。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離 將發(fā)病植株清洗干凈，取病健交界處莖段0.5 cm，剝?nèi)ネ馄?，清洗。在超凈工作臺(tái)上用消毒的解剖刀切成0.2 cm×0.3 cm的小塊，放入75%的乙醇中消毒3 min，移至5%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，取出用無菌水沖洗3次，用滅菌的濾紙吸干水分，接種在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d左右，觀察有無絲狀物出現(xiàn)[4-7]。

1.2.2 病原菌純化培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)上用滅菌的挑菌針挑取菌絲轉(zhuǎn)移到空的PDA培養(yǎng)基上。28 ℃培養(yǎng)2 d左右，觀察有無雜菌，如有雜菌繼續(xù)重復(fù)上述工作，直到PDA培養(yǎng)基中只有單一的蔓割病病原菌菌絲為止。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察 在載玻片上滴一滴乳酸棉蘭染色劑，用接種針挑一點(diǎn)菌絲，分散在染色液當(dāng)中，蓋上蓋玻片，排氣泡，2 min左右放到光學(xué)顯微鏡下100倍觀察，比較不同區(qū)域采集分離的病原菌在形態(tài)學(xué)上是否存在差異。

1.2.4 分子鑒定 對分離得到的甘薯鐮孢菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行測序分析，研究湖北省甘薯鐮孢菌的多態(tài)性。利用PDA培養(yǎng)基對待檢菌體進(jìn)行培養(yǎng)（28 ℃，48～72 h），收獲菌絲體以備核酸提取、真菌DNA基因組提取、核酸純度和濃度檢測、rDNA-ITS 擴(kuò)增，rDNA-ITS測序與分析。

2 結(jié)果與分析

通過分離純化獲得了十堰市、武漢市、宜昌市3個(gè)地區(qū)的甘薯蔓割病病原菌分離物，并對3個(gè)地區(qū)的蔓割病病原菌進(jìn)行了顯微鏡檢，結(jié)果顯示為鐮刀菌屬，且各地區(qū)的病原菌在形態(tài)上差異并不明顯（圖1）。

對3個(gè)地區(qū)分離得到的真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果如下：TCCGTAGG

T GAACCT GCG GAGGGAT CAT TACCGAGT T TACAA

C T CCCA AACCCC T GT GAACATACCACT T GT TGCCT

C GCGGA TCAGCCCGC T CCCGGT AAAACGGGACG G

CCCGCCAGAGGACCCC T AAACTCTG T T T CTATAT G

TAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAA

C T T T CAACAACGGA T C TCT T GG T TCTGGCATCGAT

G AAGAA CGC AGC AAA ATGC GAT AAG TAA TGT GA

ATTGCAGAAT TCAGT GAAT C ATCGAATCT T TGAAC

GC AC AT TGCG CCC GCC AG TA T T CTG GCGG GCAT G

CCTGTTCGAGCGTCA T T TCA ACCC TCAAGCACA GC

TTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAA

ATTGATTGGCGGTCACGTCGAGC T T CCAT AGC GTA

G TA GT AAAACCC T CG T TAC TGG TAA TCG TC GCGG

CCACG CCG T TAAAC CCCA ACTTCTGAATGT TGACC

TCGGAT CAGG TAG GAAT AC CCGC T GAAC T T AAGC

ATATCAATAAGCGGAGGA。

目的片段長度為544 bp，武漢市和宜昌市的序列完全一致。從十堰市擴(kuò)增出來的序列的385位置是C，而武漢市和宜昌市擴(kuò)增的結(jié)果該位置是T，說明引起湖北省甘薯蔓割病的甘薯鐮孢菌存在多態(tài)性。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，十堰市、武漢市、宜昌市3個(gè)地區(qū)的甘薯蔓割病病原菌100倍顯微結(jié)果顯示為鐮刀菌屬，且各地區(qū)的病原菌在形態(tài)上并無明顯差異。通過對3個(gè)地區(qū)分離得到的真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行測序分析表明，目的片段長度為544 bp，武漢市和宜昌市的病原菌真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列完全一致。但是從十堰市擴(kuò)增出來的序列的385位置是C，而武漢市和宜昌市擴(kuò)增的序列該位置是T，說明引起湖北省甘薯蔓割病的甘薯鐮孢菌在分子水平上存在多態(tài)性。這個(gè)多態(tài)性也許會(huì)導(dǎo)致不同區(qū)域分離的病原菌具有不同的致病力。后續(xù)將開展人工接種抗病鑒定試驗(yàn)，確定3個(gè)地區(qū)分離病原菌致病力的差異，以驗(yàn)證分子水平上的差異是否會(huì)帶來致病性上的差異。

參考文獻(xiàn)：

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