水稻W(wǎng)x—YMZC標(biāo)記的開發(fā)與利用

邱東峰　殷明珠　張再君　辜大川

摘要：設(shè)計了一個新分子標(biāo)記Wx-YMZC，改良檢測Wx基因中（CT）n和G/T類型的方法，使用該標(biāo)記只需要1次PCR擴(kuò)增和1次酶切即可檢測，簡化了試驗。此方法已獲專利授權(quán)（專利號：ZL2013 1 0488947.7）。通過對55份水稻資源進(jìn)行Wx基因型檢測，分析和驗證了不同Wx基因類型對直鏈淀粉含量的影響，即：①高AC（>22.0%）的資源具有較小n值（n≤14）的（CT）n重復(fù)次數(shù)的等位基因，在除糯米外的其他水稻資源中，具有低或中等AC的資源都具有較大n值（n≥16）的（CT）n重復(fù)次數(shù)的等位基因；②Wx基因中G型資源的AC高于T型資源；③Wx基因中存在著（AATT）n的重復(fù)序列，其中（AATT）6重復(fù)序列的資源多屬于高AC，（AATT）5重復(fù)序列的資源多屬于低或中等AC。還利用Wx-YMZC分子標(biāo)記對13份R7606系列品系進(jìn)行了應(yīng)用研究。

關(guān)鍵詞：水稻資源；Wx基因；直鏈淀粉含量；分子標(biāo)記；R7606

中圖分類號：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）24-6134-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.007

Abstract： Designed a new molecular marker associated with Wx gene，which had been authorized patents（ZL2013 1 0488947.7），meanwhile used this marker to detect 55 rice resources. Compared with the conventional method to detect the （CT）n and G/T type of the Wx gene， the new marker only use one PCR amplification and enzyme digestion，meanwhile， there were further analyses and validations of different Wx gene types on the influence of amylose content：1） Resources of high AC had allleles with smaller numbers of （CT） repeats， （i.e.，n≤14）， and conversely all resources of low to intermediate AC，except glutinous rice resources， had allleles with larger numbers of （CT） repeats，（i.e.，n≥16）；2） The amylose content with G type resources in Wx gene was higher than T ones； 3） Majorty of the resources with high AC had the （AATT）6 allele in the Wx gene，whereas most of the resources with low AC had the （AATT）5 allele.We analysed the （CT）n and G/T type of the Wx gene of 13 R7606 varieties.

Key words：rice resources；Wx gene； amylose content；molecular maker；R7606

隨著生活水平的不斷提高，越來越多的消費(fèi)者選擇優(yōu)質(zhì)稻米。直鏈淀粉含量（AC）是影響稻米品質(zhì)最重要的因素。直鏈淀粉主要由Wx基因編碼的顆粒性結(jié)合淀粉合成酶（GBSS）催化合成[1]，不同Wx基因類型的資源其AC存在差異。稻米的AC主要受Wx基因控制[2]。Bligh等[3]發(fā)現(xiàn)在Wx基因前導(dǎo)序列的第一內(nèi)含子5′端剪切位點的上游55 bp處存在一段（CT）n的重復(fù)序列，針對該重復(fù)序列設(shè)計了一對標(biāo)記“484/485”，一些學(xué)者對Wx座位進(jìn)行了復(fù)等位基因的分析，發(fā)現(xiàn)（CT）n存在多態(tài)性，這些多態(tài)性與水稻直鏈淀粉含量之間存在顯著的相關(guān)性[4-6]。但在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)標(biāo)記“484/485”存在PCR擴(kuò)增效果和重復(fù)性較差等問題。蔡秀玲等[7]設(shè)計一個CAPS標(biāo)記PCR-AccⅠ，該標(biāo)記在第一內(nèi)含子5′端和第一外顯子連接處的上下游設(shè)計了一對相距420 bp的引物，且這一區(qū)域中沒有另外的AccⅠ的識別位點，PCR擴(kuò)增片段為460 bp，經(jīng)AccⅠ酶切后，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，若第一內(nèi)含子+1位處是堿基G，則PCR產(chǎn)物能被酶切為403 bp和57 bp兩個片段，若第一內(nèi)含子+1位處是堿基T，則PCR產(chǎn)物不能被酶切因而仍為460 bp。

常規(guī)的檢測方法使用標(biāo)記484/485檢測Wx基因中（CT）n，使用PCR-AccⅠ標(biāo)記檢測Wx基因中G/T的類型，需要進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增和1次酶切反應(yīng)。本研究設(shè)計一個新的與Wx基因相關(guān)的分子標(biāo)記，使用該標(biāo)記只需要1次PCR擴(kuò)增和1次酶切即可檢測出Wx基因中（CT）n和G/T的類型，簡化了試驗，降低了成本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用68份秈型黏稻資源（品系），其中56～68為創(chuàng)制的R7606系列[8]資源（表1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 引物Wx-YMZ：在NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索日本晴的Wx基因全序列，用primer3.0設(shè)計一對便于測序的引物Wx-YMZ，該引物擴(kuò)增序列包含Wx基因前導(dǎo)序列第一內(nèi)含子5′端剪切位點上游55 bp處的一段（CT）n的重復(fù)序列和第一內(nèi)含子5′端SNP的G/T位點，擴(kuò)增片段大小約為848 bp，其上游引物序列為：5′-GCGTCGTCATAGACAAAAGT-3′，下游引物序列為：5′-TGACCAACTCGGCTACTAAA-3′。

引物Wx-YMZC：將引物Wx-YMZ在55個優(yōu)質(zhì)水稻資源擴(kuò)增產(chǎn)物中的測序結(jié)果與日本晴Wx基因序列相同區(qū)段使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對分析，選取高度同源的保守區(qū)段重新設(shè)計新引物Wx-YMZC，該引物包含（CT）n的重復(fù)序列和與之最近第一內(nèi)含子5′端SNP的一個G/T位點（惟一一個AccⅠ酶切位點），擴(kuò)增片段大小約為186 bp，其上游引物序列為：5′-TCACCATTCCTTCAGTTCTT-3′，下游引物序列為：5′-TCTGAATAAGAGGGGAAACA-3′。

該引物的目的旨在通過10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物中（CT）n中n值的變化，不需要引物PCR-AccⅠ的重新擴(kuò)增，直接通過AccⅠ酶切該引物擴(kuò)增的產(chǎn)物檢測其G/T型的變化。

1.2.2 水稻DNA提取 在水稻分蘗盛期取葉片，采用CTAB法提取總DNA。

1.2.3 PCR與電泳 試驗所用標(biāo)記引物均由擎科公司合成，酶切所用AccⅠ酶購自TaKaRa寶生物工程有限公司。本研究中設(shè)計的測序引物Wx-YMZ反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD PTC-200 PCR儀）中進(jìn)行。擴(kuò)增體系為25 μL，其中DNA模板0.6 μL（50 ng/μL），10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.0 μL（2.5 mmol/L），引物Wx-YMZ 0.5 μL（10 μmol/L），1U TaqDNA聚合酶（5 U/μL），超純水19.7 μL。熱循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min；55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃下延伸10 min。

新引物Wx-YMZC擴(kuò)增體系為10 μL，其中DNA模板1.0 μL（50 ng/μL），10×Buffer 1.0 μL，dNTPs 0.4 μL（2.5 mmol/L），引物Wx-YMZC 0.2 μL（10 μmol/L），1U Taq DNA聚合酶（5 U/μL），超純水7.0 μL。熱循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min；55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃下延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，快速銀染檢測Wx基因（CT）n的變化。

AccⅠ酶切：擴(kuò)增產(chǎn)物每管取10 μL，1.5 μL 10×酶解緩沖液，0.5 μL的10 U/μL AccⅠ酶，用無菌水補(bǔ)足至15 μL，混勻后于37 ℃保溫1 h，在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，檢測Wx基因的G/T多態(tài)性。

1.2.4 Wx等位基因的測序與序列分析 對引物Wx-YMZ在55個優(yōu)質(zhì)水稻資源擴(kuò)增產(chǎn)物中的測序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對分析，統(tǒng)計各資源的Wx基因型。

1.2.5 稻米品質(zhì)檢測 在供試材料完全成熟后收種，參照優(yōu)質(zhì)稻谷GB/T17891-1999的品質(zhì)分析方法，由農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（武漢）分析測試68份資源的平均直鏈淀粉含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻資源的Wx基因型與直鏈淀粉含量

引物Wx-YMZ擴(kuò)增55份水稻資源的產(chǎn)物測序結(jié)果和其直鏈淀粉含量具體見表2。

2.2 Wx基因（CT）n的變化

利用引物Wx-YMZ基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，在55份水稻資源中，共存在5種（CT）n的多態(tài)性變化，其重復(fù)數(shù)（即為n值）分別為20、18、17、13和11。

引物Wx-YMZC擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖顯示出的條帶約為186 bp，共有5種帶型，其中Basmati、Basmati Super fine各為單獨一種帶型；鄂中5號、霸王占、銀占等33種水稻資源為一種帶型；珠海占、04-657、R0521等12種水稻資源為一種帶型；晚秈98、黃華占、西山占等8種水稻資源為一種帶型，它們對應(yīng)的CT重復(fù)數(shù)分別為20、13、18、11、17，該結(jié)果與引物Wx-YMZ基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果完全一致，帶型如圖1所示。

利用引物Wx-YMZ測序得到的結(jié)果顯示，在Wx基因第一內(nèi)含子中（即位于（CT）n重復(fù)序列下游的182 bp處），存在兩種（AATT）n的多態(tài)性，即為（AATT）5和（AATT）6，其中Basmati、Basmati super fine、04-657等14份資源均為（AATT）6，鄂中5號、晚秈98、霸王占等41份資源為（AATT）5。

2.3 Wx基因的G/T多態(tài)性

分析引物Wx-YMZ基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，G型資源共有14份，T型資源共有41份。

引物Wx-YMZC擴(kuò)增產(chǎn)物能被AccⅠ酶切的資源共有14份，能被AccⅠ酶切后的兩種條帶約為137 bp（該片段包含（CT）的重復(fù)）和49 bp，其結(jié)果與引物Wx-YMZ基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果完全一致，見圖2。

2.4 Wx等位基因類型與AC分析

綜合以上結(jié)果，可將Wx基因分為5種等位基因型，其中以41份T型資源的Wx基因前導(dǎo)序列區(qū)的重復(fù)數(shù)類型為主，分別為（CT）18和（CT）17；14份G型資源共有3種，分別為（CT）20、（CT）13和（CT）11。G型水稻資源的Wx基因第一內(nèi)含子中（即位于（CT）n重復(fù)序列下游的182 bp處）的（AATT）n的重復(fù)數(shù)均為6，T型水稻資源的（AATT）n的重復(fù)數(shù)均為5，結(jié)合AC檢測結(jié)果分析可以看出，在55份材料中，G型的直鏈淀粉含量大于或等于20.60%，T型的直鏈淀粉含量小于或等于19.12%，G型的直鏈淀粉含量明顯高于T型。

2.5 應(yīng)用Wx-YMZC分子標(biāo)記初步評價13份R7606品系

選取13份R7606品系，應(yīng)用Wx-YMZC分子標(biāo)記結(jié)合AccⅠ酶切，分析其Wx基因型。結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，13份R7606品系對應(yīng)的（CT）n與材料3晚秈98指示結(jié)果一致，表明它們的n值均為17；由圖4可知，13份R7606品系均不能被AccⅠ酶切，表明它們均屬于T水稻資源，綜合分析可以得出，它們均屬于中等直鏈淀粉含量，這與稻米品質(zhì)檢測結(jié)果一致（表3）。

3 小結(jié)與討論

3.1 引物Wx-YMZC與Wx基因型的檢測

本試驗設(shè)計的新引物Wx-YMZC主要是針對檢測Wx基因的（CT）n和G/T型而設(shè)計的，其檢測出的結(jié)果和常規(guī)引物484/485與引物PCR-AccⅠ經(jīng)AccⅠ酶切后的結(jié)果完全一致，且聚丙烯凝膠電泳圖和瓊脂糖電泳圖的效果均比較理想，說明新引物Wx-YMZC在檢測Wx基因的（CT）n和G/T型方面具有良好的可靠性與可行性。

3.2 Wx基因類型與稻米品質(zhì)的關(guān)系

談移芳等[9]的研究表明高直鏈淀粉含量（>22.0%）的品種具有較小n值（n≤14）的（CT）n重復(fù)次數(shù)的等位基因，相反，在除糯米外的其他水稻品種中，具有低的或中等直鏈淀粉含量的品種都具有較大n值（n≥16）的（CT）n重復(fù)次數(shù)的等位基因。本研究中，Wx基因（CT）n重復(fù)的n值在14以下的資源共有13種，且這13種資源的直鏈淀粉含量均高于20%，屬于高直鏈淀粉含量的資源；Wx基因（CT）n重復(fù)的n值在16以上的非糯稻資源共有55種，除Basmati（n=20）外，其余41種非糯稻資源（n=17或18）的直鏈淀粉含量均在18%以下，屬于中低等直鏈淀粉含量的資源，這與前人的研究結(jié)果相符。蔡秀玲等[7]研究結(jié)果表明，Wx基因第一內(nèi)含子+1位處堿基的單核苷酸多態(tài)性G/T位點與水稻成熟種子的直鏈淀粉含量性狀緊密連鎖，共分離。若Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基為G，則水稻成熟種子中的直鏈淀粉含量均高于20%，相反，若為T，則直鏈淀粉含量均低于18%。盡管Basmati（n=20）的n值大于16，但是直鏈淀粉含量依然高于20%，屬于高直鏈淀粉含量的資源。

談移芳等[9]的研究同時證明，在（CT）n重復(fù)序列下游的182 bp處，存在一個（AATT）n的重復(fù)序列，在不同的水稻資源中，（AATT）6重復(fù)序列的資源多屬于高直鏈淀粉含量，（AATT）5重復(fù)序列的資源多屬于低或中等直鏈淀粉含量。本研究中，Wx基因中（AATT）5重復(fù)序列的資源共有41種，除1號（Basmati）外，其余40種非糯稻資源均為低或中等直鏈淀粉含量，（AATT）6重復(fù)序列的資源共有14種，且這三種資源均為高直鏈淀粉含量（高于20%），這與前人研究結(jié)論一致。Basmati資源盡管含有（AATT）5的重復(fù)序列，但由于Wx基因第一內(nèi)含子+1位處堿基為G，其直鏈淀粉含量依然高于20%，屬于高直鏈淀粉含量的資源。

在本試驗中討論的Wx基因類型中，Wx基因第一內(nèi)含子+1位處SNP位點突變G/T的變化對直鏈淀粉含量影響起著決定性的作用。

3.3 引物Wx-YMZC在水稻育種中的應(yīng)用

非糯水稻資源中稻米直鏈淀粉含量的高低與Wx基因的第一內(nèi)含子的剪接效率有關(guān)，其供位+1是G/T堿基，會影響稻米的直鏈淀粉含量；同時Wx基因中（CT）n重復(fù)次數(shù)也與稻米直鏈淀粉含量極顯著相關(guān)。本研究開發(fā)的新引物Wx-YMZC可同時檢測Wx基因中（CT）n和G/T的類型，但只需要進(jìn)行1次PCR反應(yīng)和一次酶切反應(yīng)，PCR的反應(yīng)產(chǎn)物既可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（CT）n類型，又可進(jìn)行酶切反應(yīng)通過瓊脂糖電泳檢測G/T的類型，一個產(chǎn)物兩種用途。與常規(guī)使用兩個標(biāo)記的方法相比，新標(biāo)記所擴(kuò)增產(chǎn)物以及酶切產(chǎn)物條帶清晰，實驗結(jié)果可靠，在不影響原有檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上，具有減少檢測成本，縮短檢測周期的優(yōu)勢，更適宜大規(guī)模檢測。

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