大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型的建立及其胃腸黏膜的變化

作者單位：1.100850北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所；2.100039北京，武警總醫(yī)院消化內(nèi)科

大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型的建立及其胃腸黏膜的變化

朱曉慧1,2，張成崗1，劉海峰1,2

【摘要】目的建立大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型并觀察其胃腸黏膜組織的病理學(xué)變化規(guī)律。方法采用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激的方法，將12只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組6只。對(duì)照組正常飼養(yǎng)，模型組采用10種應(yīng)激方法，包括禁食24 h、禁水24 h、夾尾(距大鼠尾根部1 cm處)5 min、晝夜顛倒24 h、4 ℃冷水游泳5 min、45 ℃環(huán)境5 min、潮濕墊料24 h、傾斜45° 24 h、行為束縛4 h、水平震蕩60次/min ，45 min，28 d內(nèi)隨機(jī)交替處理，每天一種方法，且相同的刺激至少間隔7 d以上。造模前后記錄大鼠的體重，并于造模后依次進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和糖水偏愛實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)評(píng)估，最后脫臼處死，并收集胃、回腸、盲腸、結(jié)腸等組織，包被切片后進(jìn)行HE染色。結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組大鼠體重顯著降低(P=0.0064)、穿越次數(shù)顯著減少(P=0.0001)、直立次數(shù)顯著減少(P=0.0007)、理毛次數(shù)顯著減少(P=0.0011)、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長(P=0.000006)、糖水偏愛顯著降低(P=0.008152)；病理結(jié)果顯示，造模后大鼠胃黏膜及腸道微絨毛結(jié)構(gòu)破損嚴(yán)重，細(xì)胞核輕微固縮且深染。結(jié)論慢性不可預(yù)見性多種應(yīng)激組合的方法可成功建立大鼠抑郁模型，組織學(xué)顯示這種抑郁狀態(tài)可明顯損害胃腸黏膜。

【關(guān)鍵詞】慢性應(yīng)激抑郁模型；行為學(xué)評(píng)估；組織；病理學(xué)；HE染色

通訊作者：劉海峰，E-mail:haifengliu333@163.com

【中國圖書分類號(hào)】R573

Construction of rat chronic stress depression model and its gastrointestinal mucosa change

ZHU Xiaohui1,2, ZHANG Chenggang1, and LIU Haifeng1,2.1.Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences; State Key Laboratory of Proteomics; Research Center for Military Cognition and Mental Hygiene of Chinese PLA, Beijing 100850, China；2.Department of Gastroenterology, General Hospital of Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Abstract【】ObjectiveTo establish the rat chronic stress depression model and observe its gastrointestinal mucosa change rularity. To study the feasibility of establishing the chronic stress depression model based on chronic unpredictable stress method followed by behavioral evaluation, and further observe the histopathological changes in stomach, ileum, cecum and colon using HE staining. MethodsThe based method of chronic unpredictable stress was used. A total of 12 healthy male rats were randomly divided into two groups: control group and model group, six in each group. Rats in control group were regularly raised, and those in model group were randomly and alternately treated in 28 days with 10 stress methods, such as fasting for 24 h, water deprivation for 24 h, tail nipping (1 cm of rat tail head) for 5min, day and night inversion for 24 h, 4 ℃-cold water swimming for 5min, 45℃ environment for 5min, damp bedding for 24 h, sloping 45° for 24 h, behavior constraint for 4 h, horizontal vibrating (60 times/min) for 45 min. One method was chosen in each day and the interval of the same stimulation exceeded 7 days at least. Then, the rat body weight was recorded and the rats were on open field test, forced swimming test, and sugar water preference test. Finally, rats were dislocated and samples of stomach, ileum, cecum and colon were collected, and sliced and Haematoxylin and eosin staining was performed. ResultsCompared with the control group, the rat body weight significantly decreased (P=0.0064), the number of passing through significantly decreased (P=0.0001), the number of upright standing significantly decreased (P=0.0007), the number of grooming significantly decreased (P=0.0011), the no moving time in forced swimming significantly prolonged (P=0.000006) and sugar water preference significantly decreased(P=0.008152). Furthermore, the gastric mucosa and the microvilli in intestinal tract were seriously damaged, and nuclei slightly contracted and deeply stained. ConclusionsMultiple chronic unpredictable stress method combination can correctly establish the rat chronic stress depression model, and the histology results demonstrate that the stress causes a signifcant damage in gastrointestinal mucosa.

【Key words】chronic stress depression model; behavioral evaluation; tissues; pathology; HE staining

生理性應(yīng)激反應(yīng)對(duì)機(jī)體抵御外界的刺激具有重要的預(yù)適應(yīng)和保護(hù)作用，但強(qiáng)度過大、持續(xù)時(shí)間較長的應(yīng)激反應(yīng)將嚴(yán)重影響人體的健康，甚至可造成機(jī)體應(yīng)激性抑郁及損傷[1,2]。抑郁癥是一種十分常見的多因素交互誘發(fā)的心境障礙性疾病[3]，如遺傳因素、生化因素、心理因素和社會(huì)因素等[4]，多數(shù)病例具有反復(fù)發(fā)作特性，不僅嚴(yán)重困擾患者的生活和工作，而且給其家庭和社會(huì)都造成了嚴(yán)重的影響和沉重的負(fù)擔(dān)[5,6]。研究表明，許多胃腸疾病與抑郁有關(guān)，但其機(jī)制缺乏系統(tǒng)的研究。本研究擬利用目前文獻(xiàn)報(bào)道的慢性不可預(yù)見性多種應(yīng)激組合的方法，建立大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型，并觀察慢性抑郁狀態(tài)下大鼠胃腸黏膜及微絨毛等損傷情況，不為抑郁癥作用機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)動(dòng)物模型，為臨床防治方法的研究提供了重要依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料選取成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(體重200～220 g，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)12只，隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組6只。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)飼養(yǎng)1周：自然光照，室溫(22±2)℃，自由攝取食物和水，每日定時(shí)更換飼料，通風(fēng)良好，排除其他應(yīng)激因素干擾。

1.2大鼠慢性應(yīng)激模型的建立參照文獻(xiàn)[3]報(bào)道的慢性不可預(yù)見性應(yīng)激處理方法，針對(duì)慢性應(yīng)激對(duì)照組及模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采取以下10種應(yīng)激方式：禁食24 h、禁水24 h、夾尾5 min、晝夜顛倒24 h、4 ℃冷水游泳5 min、45 ℃環(huán)境5 min、潮濕墊料24 h、傾斜45°24 h、行為束縛4 h、水平震蕩60次/min ,45 min，上述10種應(yīng)激方法在28 d內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)處理，每天采取一種方法，相同的刺激不能連續(xù)出現(xiàn)且至少間隔7 d以上。實(shí)驗(yàn)前后分別測(cè)定大鼠的體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估，包括曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和糖水偏愛實(shí)驗(yàn)。

1.3行為學(xué)評(píng)估

1.3.1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)在安靜、暗光環(huán)境下進(jìn)行，行為測(cè)定于造模前各進(jìn)行1次。將大鼠放置曠場(chǎng)箱中(自制曠場(chǎng)箱：由不透明木板制成，箱高為40 cm，底面為80 cm×80 cm的正方形，被等分成面積相等的25個(gè)等邊方格，無蓋，四周及底部封閉)，每次測(cè)定5 min，包括穿越格數(shù)(以穿越底面積塊數(shù)為水平運(yùn)動(dòng)得分)、直立次數(shù)(為垂直運(yùn)動(dòng)得分)及理毛次數(shù)，記錄各組數(shù)據(jù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前分別將大鼠置于強(qiáng)迫游泳缸[自制，直徑30 cm、缸高30 cm、水溫(23±2)℃、水深25 cm，采用透明聚乙烯材料將缸加高至70 cm]內(nèi)進(jìn)行預(yù)適應(yīng)游泳15 min，然后用毛巾擦干，24 h后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳6 min，計(jì)算大鼠后4 min在水面漂浮的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，記錄各組數(shù)據(jù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.3糖水偏愛實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前給予1%蔗糖水2瓶(200 ml/瓶)進(jìn)行糖水預(yù)適應(yīng)訓(xùn)練24 h。然后，第28天給予1%蔗糖水和純凈水各1瓶(200 ml/瓶)，1 h后稱量剩余體積，計(jì)算總液體消耗、糖水消耗、純水消耗和糖水偏愛(糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%)。實(shí)驗(yàn)完成后將大鼠進(jìn)行脫臼處死，分別收集胃、回腸、盲腸、結(jié)腸等組織并置于4%多聚甲醛溶液固定備用。

1.4HE染色將上述固定24 h后的組織樣本脫水、透明、浸蠟、包埋和切片。切片經(jīng)過脫蠟后進(jìn)行HE染色，具體步驟如下：蘇木精染色5 min，自來水沖洗多余染液；1%鹽酸乙醇(70%乙醇配制)分化15 s左右，鏡檢待細(xì)胞核和核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止，自來水沖洗30 min，蒸餾水沖洗2 min；0.5%伊紅溶液染色5 min，使細(xì)胞核著色；梯度乙醇各脫水3 min，70%→85%→95%→100%；二甲苯Ⅰ和Ⅱ透明10 min后中性樹膠封片，采集圖片并進(jìn)行分析。

2　結(jié)　　果

2.1慢性應(yīng)激后大鼠體重顯著降低造模前模型組(224.83±3.76)大鼠的體重與對(duì)照組(228.83±6.05)相比不存在差異(P=0.1169，表1)，造模后模型組(412.50±44.20)大鼠的體重低于對(duì)照組(342.50±23.52)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0064)。

2.2慢性應(yīng)激后大鼠曠場(chǎng)穿越次數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)均顯著降低模型組(57.17±13.73)大鼠曠場(chǎng)穿越次數(shù)與對(duì)照組(110.33±9.46)相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0001)；模型組(7.83±2.64)大鼠曠場(chǎng)直立次數(shù)與對(duì)照組(21.17±5.04)相比顯著降低(P=0.0007)；模型組(0.67±0.52)大鼠曠場(chǎng)理毛次數(shù)與對(duì)照組(3.67±1.03)相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0011，表1)。

2.3慢性應(yīng)激后大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長與對(duì)照組(8.67±2.50)相比，模型組(74.17±8.04)大鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000，表2)。

2.4慢性應(yīng)激后大鼠糖水偏愛性顯著降低與對(duì)照組(92.60±6.00)相比，模型組(80.80±6.00)大鼠的糖水偏愛性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0082，表3)。

表1　造模后大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表2　造模后大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表3　造模后大鼠糖水偏愛結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.5HE染色的結(jié)果慢性應(yīng)激后大鼠胃腸黏膜組織及微絨毛結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，局部區(qū)域核輕微皺縮并深染(圖1)。與對(duì)照組相比，胃黏膜組織結(jié)構(gòu)松散，破壞嚴(yán)重，細(xì)胞核皺縮且深染(圖2)，回腸、盲腸、結(jié)腸組織形態(tài)結(jié)果破壞明顯，微絨毛等斷裂，細(xì)胞局部溶解，細(xì)胞核皺縮變形并深染。

圖1　慢性應(yīng)激對(duì)照組大鼠組織病理(HE,×100)

圖2　慢性應(yīng)激模型組大鼠組織病理(HE,×100)

3　討　　論

應(yīng)激是機(jī)體應(yīng)對(duì)各種內(nèi)外界環(huán)境、社會(huì)、心理因素刺激所產(chǎn)生的一種全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)[7]。隨著社會(huì)的快速轉(zhuǎn)型發(fā)展，生活節(jié)奏的加快及生活環(huán)境壓力的加劇，人們面臨著各種各樣的應(yīng)激壓力，如果不能恰當(dāng)?shù)氖婢忂@類壓力，就可能造成健康損害，甚至導(dǎo)致抑郁狀態(tài)，這就可解釋目前抑郁相關(guān)疾病明顯增多的主要原因。為了模擬機(jī)體慢性應(yīng)激反應(yīng)，Katz等于20世紀(jì)80年代采用一系列嚴(yán)重應(yīng)激因子處理大鼠建立了慢性不可預(yù)見性應(yīng)激動(dòng)物模型[8]，該模型可有效模擬人體抑郁癥的應(yīng)激源刺激，為深入揭示慢性應(yīng)激性抑郁作用機(jī)制的研究奠定了重要基礎(chǔ)[9]。然而，慢性應(yīng)激性抑郁是復(fù)雜的過程，其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。國內(nèi)的研究現(xiàn)狀多針對(duì)胃腸道功能的變化及其機(jī)制，對(duì)器質(zhì)性損害的相關(guān)研究較少。本研究采用多種慢性不可預(yù)見性應(yīng)激組合方法建模，通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)評(píng)估，明確抑郁狀態(tài)存在，成功建立抑郁模型后觀察胃腸黏膜損害的情況。

通過比較分析大鼠的體重明顯降低，說明應(yīng)激反應(yīng)機(jī)體代謝紊亂，以致體重下降明顯。深入確定大鼠抑郁指標(biāo)，采用行為學(xué)評(píng)估及糖水偏愛實(shí)驗(yàn)其快感缺失程度，研究結(jié)果提示經(jīng)過慢性應(yīng)激處理后，大鼠的曠場(chǎng)反應(yīng)性明顯低于對(duì)照組，糖水偏愛性明顯降低，說明大鼠處于嚴(yán)重的抑郁狀態(tài)。

慢性應(yīng)激反應(yīng)中，消化器官作為直接的負(fù)累臟器表現(xiàn)出了明顯的生理及病理性變化。為了深入闡明慢性應(yīng)激后大鼠胃腸組織病理學(xué)變化，筆者利用HE染色方法對(duì)胃腸組織進(jìn)行染色，采集圖片分析大鼠胃、回腸、盲腸、結(jié)腸組織病理變化。結(jié)果顯示，不僅胃黏膜破壞，而且大鼠回腸、盲腸、結(jié)腸組織黏膜及微絨毛等嚴(yán)重破壞，細(xì)胞變形。通過病理學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激性刺激可導(dǎo)致大鼠行為變慢，且臟器生理結(jié)構(gòu)也受損，后續(xù)采用藥物干預(yù)，以期找到合適的預(yù)防和治療藥物。

本研究利用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激方法建立了大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型，通過病理學(xué)檢測(cè)確定了大鼠慢性應(yīng)激性損傷的變化規(guī)律，為深入揭示慢性應(yīng)激抑郁的作用機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。

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(2015-01-15收稿2015-03-16修回)

(責(zé)任編輯岳建華)