大黃素對(duì)肺纖維化大鼠的保護(hù)作用及部分機(jī)制研究

劉理靜，錢　紅，張　平

(1.湖南醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，湖南 懷化　418000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng)　421001)

大黃素對(duì)肺纖維化大鼠的保護(hù)作用及部分機(jī)制研究

劉理靜1，錢紅1，張平2

(1.湖南醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，湖南 懷化418000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng)421001)

摘要:目的觀察大黃素對(duì)博萊霉素所致大鼠肺纖維化的影響，并探討其保護(hù)機(jī)制。方法將60只♂ SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、大黃素低劑量干預(yù)組、大黃素高劑量干預(yù)組和潑尼松組，每組10只，后4組經(jīng)氣管內(nèi)注入博萊霉素建立大鼠肺纖維化模型，從d 2開始，低、高劑量干預(yù)組大鼠分別予20、80 mg·kg-1大黃素2 mL灌胃，潑尼松組以5 mg·kg-1醋酸潑尼松2 mL灌胃，其余2組予2 mL生理鹽水灌胃，d 28處死所有大鼠，取出肺組織行HE染色和Masson染色，測(cè)定肺組織羥脯氨酸(HYP)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)含量，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-6、IL-17濃度，通過(guò)Western blot分析肺組織中Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白 1(Keap 1)、NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)、核因子-κB(NF-κB) p65表達(dá)。結(jié)果低、高劑量干預(yù)組及潑尼松組肺泡炎癥和肺纖維化程度明顯輕于模型組(P<0.05或P<0.01)。與正常對(duì)照組或假手術(shù)組比較，模型組肺組織HYP、MDA含量、胞核Nrf2、NF-κB p65表達(dá)水平及血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度增加(P<0.01)，而肺組織SOD、GSH-Px、CAT含量及胞質(zhì)Keap 1表達(dá)水平降低(P<0.01)。經(jīng)低、高劑量大黃素或潑尼松處理后，肺組織HYP、MDA含量、胞質(zhì)Keap 1表達(dá)水平、胞核NF-κB p65表達(dá)水平及血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度減少，肺組織SOD、GSH-Px、CAT含量及胞核Nrf2表達(dá)水平升高，與模型組比較，差異均有顯著性(P<0.01)。高劑量干預(yù)組、潑尼松組上述指標(biāo)改善程度優(yōu)于低劑量干預(yù)組(P<0.05)，但高劑量干預(yù)組與潑尼松組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。結(jié)論大黃素可能通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力及抑制炎癥反應(yīng)對(duì)肺纖維化大鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞:大黃素；肺纖維化；羥脯氨酸；NF-E2相關(guān)因子2；氧化應(yīng)激；核因子-κB；炎癥反應(yīng)

肺纖維化(pulmonary fibrosis)是由各種肺內(nèi)外致病因素所致的間質(zhì)性肺疾病，以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在肺間質(zhì)浸潤(rùn)、纖維母細(xì)胞增生及纖維結(jié)締組織沉積于肺間質(zhì)為特征，它是一系列慢性肺部疾病的最終結(jié)局，對(duì)人類健康危害極大。肺纖維化是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，盡管發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但氧化應(yīng)激和過(guò)度炎癥反應(yīng)在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。近年來(lái)，肺纖維化的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，臨床上仍缺乏有效的治療手段。因此，尋找對(duì)肺纖維化有效的治療藥物已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)的迫切需要。大黃素屬于蒽醌類衍生物，是中藥大黃的主要有效單體，具有明顯的抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化應(yīng)激等藥理作用[2]。新近研究表明，大黃素通過(guò)下調(diào)白介素(interleukin, IL)-7、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)減輕博萊霉素所致的大鼠肺纖維化程度[3-4]。然而，大黃素對(duì)肺纖維化的保護(hù)作用是否與抗炎和抗氧化應(yīng)激有關(guān)，尚未見報(bào)道。為此，本研究采用博萊霉素氣管內(nèi)注射建立SD大鼠肺纖維化模型，觀察大黃素對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理學(xué)改變、羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP)含量、氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)的影響，探索大黃素對(duì)肺纖維化大鼠的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制，從而為其臨床應(yīng)用于肺纖維化的防治提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥品♂ SD大鼠60只，8~10周齡，體質(zhì)量為250~300 g，清潔級(jí)，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYKK(湘)2010-0006，予常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，并自由飲水。博萊霉素A5系太和制藥有限公司產(chǎn)品。產(chǎn)品批號(hào)：070501。大黃素由國(guó)家藥物和生物制品檢定研究所(NICPBP)提供，濃度>98%，溶解于二甲基亞砜(美國(guó) Sigma公司)后制成混懸液。醋酸潑尼松片購(gòu)于天津太平洋制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)080201。

1.2模型制備與分組給藥將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、大黃素低劑量干預(yù)組、大黃素高劑量干預(yù)組和潑尼松組，每組10只。后5組通過(guò)腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠后，從頸正中部位切開，暴露氣管，其中模型組、低劑量干預(yù)組、高劑量干預(yù)組和潑尼松組向氣管內(nèi)一次性注入溶解了博萊霉素A5(5 mg·kg-1)的生理鹽水0.2 mL，假手術(shù)組注入等量生理鹽水，然后將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)，以使藥液在肺內(nèi)分布均勻。從次日開始，正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組予2 mL生理鹽水灌胃，低、高劑量干預(yù)組分別予20、80 mg·kg-1大黃素混懸液2 mL灌胃，潑尼松組以5 mg·kg-1醋酸潑尼松(溶解于2 mL生理鹽水中)灌胃，均為1次/日。d 28，大鼠麻醉后開胸，以心臟采血法采集血液3 mL，離心并提取血清，保存于-20℃冰箱，用于檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-6、IL-17的水平，再頸動(dòng)脈放血處死全部大鼠，截取右肺組織，迅速放入-70℃液氮中凍存，用于HYP、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione-peroxidase, GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)含量和Western blot檢測(cè)，然后經(jīng)主支氣管向左肺內(nèi)注入 10%中性福爾馬林液，使胸膜展開后置于10%中性福爾馬林中固定 24 h以上，石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE) 染色及Masson 染色。

1.3HE染色和Masson染色左肺石蠟切片行常規(guī)HE染色和Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。參照 Szapiel等[5]的方法用HE染色評(píng)定肺組織肺泡炎癥程度，0分：無(wú)肺組織炎；1分：輕度肺組織炎，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)僅限于局部或近胸膜部，面積小于全肺的 20%；2分：中度肺組織炎，受累面積占全肺的 20%～50%；3分：重度肺組織炎，受累面積大于 50%。Masson染色評(píng)定肺組織纖維化程度，0分：無(wú)肺纖維化；1分：輕度肺纖維化，受累面積少于全肺 20%；2分：中度肺纖維化，受累面積占 20%～50%；3分：重度肺纖維化，受累面積大于 50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。

1.4肺組織HYP、MDA、SOD、GSH-Px、CAT含量的測(cè)定取適量右肺組織勻漿，離心，提取上清液，通過(guò)BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)測(cè)定蛋白濃度。然后，采用商業(yè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定HYP、MDA、SOD、GSH-Px、CAT的含量。

1.5Western blot取適量右肺組織，分別按照細(xì)胞質(zhì)/核蛋白提取試劑盒說(shuō)明(美國(guó)ProMab公司)提取各組細(xì)胞胞質(zhì)蛋白和核蛋白，并進(jìn)行蛋白定量。常規(guī)制備SDS-PAGE膠，上樣、電泳并移膜，此后，分別滴加1 ∶500兔抗大鼠 Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap 1)、核內(nèi)NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2, Nrf2)、核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)p65、β-actin一抗(美國(guó)Santa Cruz公司)，并在4℃條件下孵育過(guò)夜，洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶2 500)，室溫孵育1 h，ECL 顯色、暗室曝光、掃描，得出灰度值，目的蛋白(Keap 1、Nrf2、NF-κB p65)相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.6血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度檢測(cè)通過(guò)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)定各組血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度，試劑盒購(gòu)于深圳晶美生物工程公司，嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠商提供的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2結(jié)果

2.1大黃素對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理學(xué)改變和HYP含量的影響正常對(duì)照組、假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見任何病理改變；模型組肺泡間隔明顯增厚，多數(shù)肺泡壁結(jié)構(gòu)紊亂，可見較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化明顯；大黃素低、高劑量干預(yù)組和潑尼松組上述病變減輕，尤其以大黃素高劑量干預(yù)組和潑尼松組改善明顯(Fig 1、2)。由Tab 1可知，與模型組比較，大黃素低、高劑量干預(yù)組和潑尼松組肺泡炎與肺纖維化評(píng)分及肺組織HYP含量明顯降低，差異均有顯著性(P<0.05 orP<0.01)，此外，大黃素高劑量干預(yù)組、潑尼松組上述指標(biāo)低于大黃素低劑量干預(yù)組(P<0.05)，但假手術(shù)組與正常對(duì)照組及大黃素高劑量干預(yù)組與潑尼松組之間比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

Tab 1　Comparison of pulmonary inflammation and fibrosis

**P<0.01vsnormal control group or sham operation group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;ΔP<0.05vslow-dose intervention group

2.2大黃素對(duì)肺纖維化大鼠肺組織勻漿液中MDA、SOD、GSH-Px和CAT含量的影響 如Tab 2所示，假手術(shù)組肺組織勻漿液中MDA、SOD、GSH-Px和CAT含量與正常對(duì)照組無(wú)區(qū)別(P>0.05)，與正常對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組MDA含量升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px和CAT含量則降低(P<0.01)，采用低、高劑量大黃素及潑尼松處理后，MDA含量減少，而SOD、GSH-Px和CAT含量增加，與模型組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，此外，大黃素高劑量干預(yù)組、潑尼松組MDA含量較大黃素低劑量干預(yù)組降低(P<0.05)，但SOD、GSH-Px和CAT含量較大黃素低劑量干預(yù)組增加(P<0.05)，然而，大黃素高劑量干預(yù)組與潑尼松組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.3大黃素對(duì)肺纖維化大鼠肺組織中Keap 1/Nrf2信號(hào)通路的影響 為了明確大黃素增強(qiáng)肺纖維化大鼠抗氧化能力的機(jī)制，利用Western blot檢測(cè)各組肺組織中Keap 1、Nrf2表達(dá)，如Fig 3所示，假手術(shù)組胞質(zhì)Keap 1及胞核Nrf2表達(dá)水平與正常對(duì)照組無(wú)區(qū)別(P>0.05)，與正常對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組胞質(zhì)Keap 1表達(dá)水平減少(P<0.01)，而胞核Nrf2表達(dá)水平增加(P<0.01)，在大黃素、潑尼松處理后，胞質(zhì)Keap 1表達(dá)水平進(jìn)一步減少，胞核Nrf2表達(dá)水平進(jìn)一步增加，與模型組相比，差異均有顯著性(P<0.01)，高劑量大黃素干預(yù)組、潑尼松組胞質(zhì)Keap 1表達(dá)水平較低劑量大黃素干預(yù)組降低(P<0.05)，但胞核Nrf2表達(dá)水平較大黃素低劑量干預(yù)組升高(P<0.05)，此外，大黃素高劑量干預(yù)組Keap 1、Nrf2表達(dá)水平與潑尼松組無(wú)明顯差別(P>0.05)。

Fig 1HE staining of pulmonary tissues among groups (×200)

A: Normal control group; B: Sham operation group; C: Model group; D: Low-dose intervention group; E: High-dose intervention group; F: Prednisone group

Fig 2Masson staining of pulmonary tissues among groups (Blue represents collagen fiber,×200)

A: Normal control group; B: Sham operation group; C: Model group; D: Low-dose intervention group; E: High-dose intervention group; F: Prednisone group

Tab 2　Comparison of pulmonary MDA, SOD, GSH-Px and CAT contents among groups(n=10)

**P<0.01vsnormal control group or sham operation group;##P<0.01vsmodel group;ΔP<0.05vslow-dose intervention group

Fig 3Expression of Keap 1 and Nrf2 in the

pulmonary tissues among groups

A: Normal control group; B: Sham operation group; C: Model group; D: Low-dose intervention group; E: High-dose intervention group; F: Prednisone group.**P<0.01vsnormal control group or sham operation group;##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vslow-dose intervention group

2.4大黃素對(duì)肺纖維化大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度的影響采用雙抗體夾心ELISA測(cè)定各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)，模型組血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度明顯高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01)，與模型組比較，低、高劑量大黃素干預(yù)組和潑尼松組血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度明顯減少(P<0.01)，而且高劑量大黃素干預(yù)組、潑尼松組上述因子濃度低于低劑量大黃素干預(yù)組(P<0.05)，但高劑量大黃素干預(yù)組與潑尼松組相比，差異無(wú)顯著性(P>0.05)，見Tab 3。

Tab 3　Comparison of serum TNF-α, IL-6 and

**P<0.01vsnormal control group or sham operation group;##P<0.01vsmodel group;ΔP<0.05vslow-dose intervention group

2.5大黃素對(duì)肺纖維化大鼠肺組織NF-κB p65表達(dá)的影響為了進(jìn)一步探討大黃素抑制肺纖維化大鼠炎癥反應(yīng)的機(jī)制，通過(guò)Western blot檢測(cè)各組胞核NF-κB p65表達(dá)，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組胞核NF-κB p65表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)，但模型組胞核NF-κB p65表達(dá)水平較正常對(duì)照組和假手術(shù)組升高(P<0.01)，經(jīng)低、 高劑量大黃素及潑尼松治療后，胞核NF-κB p65表達(dá)水平下調(diào)，與模型組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，而且高劑量大黃素干預(yù)組、潑尼松組胞核NF-κB p65表達(dá)水平較低劑量大黃素干預(yù)組減少(P<0.05)，此外，高劑量大黃素干預(yù)組胞核NF-κB p65表達(dá)水平與潑尼松組相比，差異無(wú)顯著性(P>0.05)，見Fig 4。

Fig 4　Expression of NF-κB p65 in the nucleus among groups

A: Normal control group; B: Sham operation group; C: Model group; D: Low-dose intervention group; E: High-dose intervention group; F: Prednisone group.**P<0.01vsnormal control group or sham operation group;##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vslow-dose intervention group

3討論

肺纖維化是以彌漫性肺泡炎癥和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，最終形成肺間質(zhì)纖維化為特征性病理改變的慢性進(jìn)展性疾病，病因眾多，無(wú)機(jī)或有機(jī)粉塵、吸入氣體、感染、化學(xué)制劑、藥物、放射線、膠原血管病等是目前已知的病因，但大部分病例的病因不清楚。針對(duì)肺纖維化的治療以往以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺或細(xì)胞毒類藥物如硫唑嘌呤以及抗纖維化制劑如N-乙酰半胱氨酸、秋水仙堿等為主，但療效都不佳，且長(zhǎng)期使用激素和免疫抑制劑可出現(xiàn)感染、耐藥等副作用，限制了其臨床應(yīng)用[6]。近年來(lái)，從中藥及天然植物中提取的毒副作用低的有效單體成分(如白藜蘆醇)已成為纖維化疾病治療的新途徑[7]。大黃素化學(xué)名稱為1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌，是從中藥大黃的干燥根中分離出來(lái)的主要有效單體，具有利尿、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性，有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠抑制肺成纖維細(xì)胞增殖[8]。HYP是脯氨酸羥化酶催化前α-肽鏈中脯氨酸殘基而形成，主要存在于膠原中，其含量可以間接反映膠原的含量。本研究中，正常對(duì)照組、假手術(shù)組氣管切開術(shù)后28 d均未發(fā)現(xiàn)肺泡炎癥與纖維化，兩組肺組織HYP含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以排除手術(shù)本身?yè)p傷以及氣管內(nèi)灌注生理鹽水的影響；此外，大黃素低、高劑量干預(yù)組肺泡炎與肺纖維化評(píng)分及肺組織HYP含量較模型組降低，劑量越大，效果越明顯，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[4]。而且潑尼松組上述指標(biāo)低于模型組和低劑量大黃素干預(yù)組，但與高劑量大黃素干預(yù)組無(wú)區(qū)別，進(jìn)一步提示大黃素對(duì)博萊霉素所致的肺纖維化大鼠有良好的治療效果，并且80 mg·kg-1大黃素與5 mg·kg-1醋酸潑尼松作用相當(dāng)。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)自由基如活性氧產(chǎn)生過(guò)多，超出了機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡的一種狀態(tài)。氧化應(yīng)激在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要作用已得到了人們的共識(shí)[9]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。SOD、GSH-Px、CAT是內(nèi)源性抗氧化酶，可清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受自由基的損傷，其活力的高低可反映機(jī)體清除氧自由基的能力。Keap 1/Nrf2信號(hào)通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的抗氧化應(yīng)激通路，Nrf2屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族，在生理情況下，與Keap 1偶聯(lián)，錨定于胞質(zhì)中，處于失活狀態(tài)，當(dāng)受到活性氧或其它親電子試劑攻擊后，Keap 1與Nrf2解離，Nrf2被激活并進(jìn)行核轉(zhuǎn)位，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)SOD、GSH-Px和CAT基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組肺組織MDA含量、胞核Nrf2表達(dá)水平升高，但肺組織SOD、GSH-Px、CAT含量及胞質(zhì)Keap 1表達(dá)水平降低，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)氧化應(yīng)激損傷在肺纖維化的形成過(guò)程中起重要作用，雖然Nrf2活化導(dǎo)致SOD、GSH-Px、CAT生成增多，但這些酶的消耗遠(yuǎn)超過(guò)生成，因而其活性降低。本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)大黃素處理肺纖維化大鼠可降低肺組織MDA含量及下調(diào)胞質(zhì)Keap 1表達(dá)，而增加肺組織SOD、GSH-Px、CAT含量及上調(diào)胞核Nrf2表達(dá)，并且大黃素高劑量干預(yù)組優(yōu)于低劑量干預(yù)組，說(shuō)明大黃素可能通過(guò)激活Keap 1/Nrf2信號(hào)通路增加肺纖維化大鼠體內(nèi)抗氧化酶的活性，清除自由基，從而拮抗脂質(zhì)過(guò)氧化引起的肺組織損害。眾多研究證實(shí)[11-12]，大黃素能夠激活Nrf2，從而發(fā)揮抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷作用。由于大黃素給藥后，可刺激胞質(zhì)中Keap 1/Nrf2復(fù)合物的分離、Keap 1的降解及Nrf2核轉(zhuǎn)位，因而，與模型組相比，大黃素低、高劑量干預(yù)組胞質(zhì)Keap 1表達(dá)水平進(jìn)一步減少，而胞核Nrf2表達(dá)水平進(jìn)一步增加。

炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、活化所致細(xì)胞因子的異常分泌與肺纖維化的病理生理過(guò)程密切相關(guān)。TNF-α、IL-6、IL-17均為導(dǎo)致肺損傷的重要促炎介質(zhì)，抑制這些介質(zhì)的產(chǎn)生可明顯緩解肺纖維化[13-14]。本研究結(jié)果顯示，利用大黃素干預(yù)治療可明顯降低肺纖維化大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度，并且高劑量干預(yù)組血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度低于低劑量干預(yù)組，說(shuō)明抑制炎癥反應(yīng)可能是大黃素抗肺纖維化的重要機(jī)制之一。NF-κB主要是由p50、p65兩個(gè)亞基組成的異二聚體，當(dāng)NF-κB被激活后，由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與特異性κB 序列結(jié)合，能強(qiáng)烈誘導(dǎo)TNF-α、IL-6、IL-17等促炎介質(zhì)的表達(dá)[15]。本組前期研究證實(shí)，抑制NF-κB激活對(duì)肺纖維化大鼠有保護(hù)作用[16]。為了進(jìn)一步明確大黃素減少這些因子的產(chǎn)生是否和NF-κB有關(guān)，本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)肺組織中胞核NF-κB p65表達(dá)，結(jié)果顯示，大黃素低、高劑量干預(yù)組胞核NF-κB p65表達(dá)水平較模型組下調(diào)，而且高劑量干預(yù)組效果強(qiáng)于低劑量干預(yù)組，表明大黃素通過(guò)阻礙NF-κB 核轉(zhuǎn)位抑制肺纖維化大鼠促炎因子的分泌。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，大黃素可抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能與增強(qiáng)抗氧化能力以及減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)，這些作用機(jī)制的揭示為指導(dǎo)大黃素的開發(fā)及臨床用藥提供了可靠的藥理學(xué)依據(jù)。

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.024.html

Protective effect of emodin on rats with pulmonary fibrosis

and its partial mechanisms

LIU Li-Jing1, QIAN Hong1, ZHANG Ping2

(1.DeptofClinicalMedicine,HunanUniversityofMedicine,HuaihuaHunan418000,China；

2.DeptofRespiration,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China)

Abstract:AimTo observe the influence of emodin on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats, and explore its protective mechanisms. MethodsSixty SD rats were randomly divided into normal control group, sham operation group, model group, low-dose intervention group, high-dose intervention group and prednisone group. Each group included 10 animals. Rats in the latter 4 groups were intratracheally administered with bleomycin to establish pulmonary fibrosis model. From the second day, rats in low- and high-dose intervention groups were intragastrically treated with 2 mL of 20 and 80 mg·kg-1emodin, respectively. Prednisone group were intragastrically administrated with 2 mL of 5 mg·kg-1prednisone acetate. However, control and model groups were treated with 2 mL of normal saline. All rats were sacrificed on day 28. Pulmonary tissues were then removed, and HE and Masson staining were performed. The contents of hydroxyproline (HYP), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathione-peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) in pulmonary tissues were measured. Serum concentrations of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-6 and IL-17 were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap 1), nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) and nuclear factor-κB (NF-κB) p65 in pulmonary tissues was analyzed using Western blot. ResultsThe pulmonary inflammation and fibrosis in low- and high-dose intervention as well as prednisone groups was significantly improved when compared with model group (P<0.05, 0.01). In comparison with normal control group or sham operation group, pulmonary HYP and MDA contents, Nrf2 and NF-κB p65 expression levels in the nucleus, and serum concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-17 were increased (P<0.01), but pulmonary SOD, GSH-Px and CAT contents and Keap 1 expression levels in the cytoplasm were decreased (P<0.01) in model group. Upon treatment with low- and high-dose emodin or prednisone, pulmonary HYP and MDA contents, Keap 1 expression levels in the cytoplasm, NF-κB p65 expression levels in the nucleus, and serum concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-17 were reduced while pulmonary SOD, GSH-Px and CAT contents and Nrf2 expression levels in the nucleus were enhanced as compared to model group (P<0.01). The above indicators were significantly improved in high-dose intervention and prednisone groups compared with low-dose intervention group (P<0.05). Nevertheless, There was no significant difference between high-dose intervention group and prednisone group (P>0.05). ConclusionEmodin may protect against rats with pulmonary fibrosis by enhancing antioxidative ability and inhibiting inflammatory response.

Key words:emodin; pulmonary fibrosis; hydroxyproline; nuclear factor-erythroid 2-related factor 2; oxidative stress; nuclear factor-κB; inflammatory response

通訊作者張平(1954-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：肺纖維化的防治，，Tel:0734-8281948,E-mail:zp9707@sohu.com

作者簡(jiǎn)介：劉理靜(1976-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：肺纖維化的防治，E-mail：wsfyz-000@163.com；

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No 10A107)；湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 08JJ5003)

收稿日期:2014-11-24,修回日期:2014-12-25

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R282.71；R322.35；R392.12；R563.13；R975.3

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.024