生物醫(yī)用材料聚羥基脂肪酸酯(PHA)的研究進(jìn)展 *

*：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31260015，31160036).**：通信作者，碩士，教授，E-mail：ruijunduan@163.com

魏曉星(1980~)，男，漢族，山東籍，博士.

生物醫(yī)用材料聚羥基脂肪酸酯(PHA)的研究進(jìn)展*

魏曉星1，張華磊2，段瑞君3**

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810016；2.開封市兒童醫(yī)院麻醉科，河南 開封 475000；

3.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016)

中圖分類號O632.52

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.012

聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate，簡稱PHA)是微生物合成的一大類高分子聚酯，以疏水性顆粒形式廣泛存在于微生物細(xì)胞中[1-3]，具有可降解性、生物相容性和多變的材料學(xué)性能，可用作傳統(tǒng)石油來源的不可降解塑料的補(bǔ)充或醫(yī)用組織工程材料等，現(xiàn)已引起醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前，PHA的生產(chǎn)成本仍然較高，由此制約了其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用開發(fā)。許多研究工作致力于從菌種構(gòu)建、發(fā)酵過程優(yōu)化等方面降低PHA的生產(chǎn)成本，本文就這方面的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1PHA概述

1.1　PHA的化學(xué)結(jié)構(gòu)

PHA是由單體羥基脂肪酸(hydroxyalkanoicacid，HA)聚合而成的高分子化合物，通常側(cè)鏈基團(tuán)鏈長在3~14個碳原子范圍且高度可變，不同的PHA及其單體具有不同的側(cè)鏈基團(tuán)。

圖1　PHA的結(jié)構(gòu)通式

PHA的基本結(jié)構(gòu)如圖1所示。其中，m=1、2或3；n為單體數(shù)目；R代表側(cè)鏈，多為C1～C13的不同鏈長的正烷基，也可以是帶支鏈，不飽和或帶取代基的烷基。當(dāng)m=1、R為甲基時，為聚3-羥基丁酸酯(PHB)，是PHA中最常見而又最重要的一種[2]。

根據(jù)單體的碳鏈長短，PHA可以被分為兩類：短鏈(short-chain-length，SCL)PHA，其單體由3~5個碳原子組成；中長鏈(medium-chain-length，MCL)PHA，其單體由6~14個碳原子組成。根據(jù)單體的組成的種類，PHA可包括：均聚物，只由一種單體組成；共聚物，含有一種以上的單體。

1.2　PHA的材料性能

PHA的材料學(xué)性質(zhì)主要是由其單體組成決定的。PHA的單體種類多樣，鏈長、側(cè)鏈基團(tuán)的不同，使PHA有不同的材料學(xué)性質(zhì)[3]。除了類似于傳統(tǒng)塑料的熱塑性以外，PHA還具有一些獨(dú)特性質(zhì)，包括生物可再生性、生物可降解性、生物相容性、疏水性、光學(xué)異構(gòu)性等。

PHB在某些性能上類似于傳統(tǒng)塑料，力學(xué)性質(zhì)與聚丙烯(PP)相似，但是由于PHB的化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單規(guī)整，結(jié)晶度高達(dá)60%~80%，因而性脆，折裂伸長率很低，大大限制了它的應(yīng)用范圍。而羥基丁酸和其他單體形成的共聚物如PHBV[poly-3 hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate]或PHB HHx[Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)]的物理參數(shù)和加工性能則大大提高[4]。

表1　幾種PHA與傳統(tǒng)塑料的物化性能比較 [4]

注：PHBV，聚羥基丁酸羥基戊酸酯poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)；PHBHHx，聚羥基丁酸羥基己酸酯poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)；MCL PHA為含4% C10單體、80% C8單體和10% C6單體的共聚物。括號中為HV和HHx的含量，表中的比例均為摩爾百分比.

1.3　PHA的應(yīng)用前景

PHA具有極為廣闊的應(yīng)用前景。近年來，由于能源消耗以及廢棄物過度排放導(dǎo)致全球環(huán)境惡化，我國和其他很多國家都加大了對環(huán)境和生物技術(shù)的投入。環(huán)境友好型材料和生物材料，特別是來源于可再生資源的材料有了迅速的發(fā)展。PHA就是其中重要的一種，可以通過生物技術(shù)，尤其是工業(yè)微生物技術(shù)獲得這種高分子材料[5]。

由PHA的基本結(jié)構(gòu)可以看出其結(jié)構(gòu)具有多元性，不同單體的PHA組成結(jié)構(gòu)不同。結(jié)構(gòu)多樣化也會帶來性能多樣化，多樣的理化性質(zhì)拓展了PHA的應(yīng)用范圍，使其在用作生物可降解材料時具有明顯的優(yōu)勢。PHA還具有良好的生物相容性、生物可降解性和可加工性能，因此可以作為高端的生物醫(yī)用材料[2]。其中，PHBHHx已被證明在血管組織工程[6]、軟骨組織工程[7]和人造神經(jīng)導(dǎo)管[8]等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。

目前PHA已經(jīng)成為生物材料領(lǐng)域最為活躍的研究熱點(diǎn)之一。隨著研究的深入，不斷有新型的PHA材料被人工合成出來。此外，PHA還具有非線性光學(xué)活性、壓電性、氣體相隔性等許多高附加值性能，使其可應(yīng)用在藥物緩釋載體、藥品及精細(xì)化學(xué)品等領(lǐng)域[9]。

2PHA生產(chǎn)中遇到的問題和探索

較高的生產(chǎn)成本是限制PHA領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的主要原因。市場上目前只有PHB和PHBV實(shí)現(xiàn)了半商業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)。如何降低PHA的生產(chǎn)成本是PHA研究的焦點(diǎn)。PHB是PHA家族中發(fā)現(xiàn)最早，研究背景最為清楚，結(jié)構(gòu)最簡單，也是最早被用來進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的成員。通過對PHB發(fā)酵生產(chǎn)的研究，人們逐漸積累出了有關(guān)高產(chǎn)菌種篩選與改造、培養(yǎng)基成分優(yōu)化、發(fā)酵流程優(yōu)化、下游PHA提取工藝等經(jīng)驗(yàn)?，F(xiàn)在一般認(rèn)為加速PHA的工業(yè)化進(jìn)程途徑有三個：研發(fā)新型PHA材料；提高PHA的產(chǎn)量；降低生產(chǎn)成本[10]。

目前，應(yīng)用微生物發(fā)酵生產(chǎn)仍是PHA最有效的生產(chǎn)方式。PHA生產(chǎn)的關(guān)鍵是獲得高產(chǎn)、高轉(zhuǎn)化率的微生物菌株。同時，這些微生物生產(chǎn)菌必須能夠利用廉價的碳源，從而保證PHA的生產(chǎn)成本不至過高。迄今為止人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多條PHA的合成途徑，除了一條代謝途徑是由乙酰輔酶A通過二聚反應(yīng)合成PHA單體以外[3]，其他途徑中PHA的合成都是由脂肪酸代謝的中間體衍生而來，涉及到脂肪酸的合成和降解過程。依據(jù)與PHA前體在結(jié)構(gòu)上的相似性，可以將碳源分為非相關(guān)碳源和相關(guān)碳源。前者在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與羥基脂肪酸單體不具有相似性，如葡萄糖、葡萄糖酸鈉等；后者在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與羥基脂肪酸單體有較高的相關(guān)性或相似性，如不同碳鏈長度的脂肪酸[1]。

細(xì)菌使用相關(guān)碳源，經(jīng)過反應(yīng)得到各種PHA(尤其是中長鏈PHA)前體的過程簡單，但是這類碳源往往價格昂貴、難以獲得。在PHA的工業(yè)化生產(chǎn)中，能夠使用易于獲得的簡單碳源，如葡萄糖、乳糖、甘油等，為菌體提供各種不同長度的單體，是PHA廉價生產(chǎn)的重要因素。這就需要加深對PHA合成途徑的認(rèn)識，努力發(fā)現(xiàn)甚至創(chuàng)造一些能夠利用廉價非相關(guān)碳源的合成途徑，進(jìn)行所需PHA的生產(chǎn)。

運(yùn)用現(xiàn)代方法，包括基因工程技術(shù)、代謝路徑修飾甚至合成生物學(xué)方法，開發(fā)PHA高產(chǎn)菌株是研究中最主要的思路[10]。還可以對發(fā)酵流程進(jìn)行優(yōu)化，控制培養(yǎng)過程中的相關(guān)條件如溫度、酸堿度、通氣量、流加速率等，使細(xì)菌生長和PHA的積累達(dá)到最大化[11-13]。近期研究發(fā)現(xiàn)，菌體中NADPH的水平對PHA的產(chǎn)量影響較大，可通過相應(yīng)的輔酶工程手段提高PHA含量[14]。此外，基于嗜鹽菌開發(fā)的不滅菌連續(xù)發(fā)酵工藝可顯著降低PHA生產(chǎn)過程的能源、底物等成本，使生產(chǎn)過程更加簡單，為低成本PHA的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了另一良好的思路[15]。

總之，為了能使PHA的成本在市場上具有競爭力，需要對現(xiàn)有生產(chǎn)方式進(jìn)行改進(jìn)，包括對生產(chǎn)菌株的改造以及生產(chǎn)過程的優(yōu)化。對此業(yè)界普遍的要求是，PHA的積累率要占細(xì)胞干重的80%以上，碳源轉(zhuǎn)化率在50%以上，PHA的提取率達(dá)90%，細(xì)胞密度達(dá)到或超過150 g/L，批次發(fā)酵時間少于48小時或者連續(xù)發(fā)酵。

3利用工業(yè)廢棄物生產(chǎn)PHA

對于如何降低PHA的生產(chǎn)成本，學(xué)者們做了許多嘗試，尤其是利用各種工業(yè)及農(nóng)業(yè)活動產(chǎn)生的廢棄物作為PHA的生產(chǎn)原料。PHA整個生產(chǎn)成本的50%是由原材料成本決定的，因此將廢棄物作為PHA生物合成的起始材料，形成有成本效益的生物聚酯生產(chǎn)體系，不僅有利于解決PHA原材料成本高的問題，還便于克服廢料的處理問題[16]。

3.1　乳品業(yè)的剩余乳清

全球乳清每年的產(chǎn)量約為1.35×108t，乳糖是乳清中的主要碳水化合物，可以作為生長基質(zhì)以及許多生物技術(shù)產(chǎn)品的原料，且乳糖的成本僅為葡萄糖的1/4[17]。利用乳清生產(chǎn)PHA的主要優(yōu)點(diǎn)是原料來源相對穩(wěn)定，缺點(diǎn)是可以將乳清直接轉(zhuǎn)化成PHA的菌株較少，需要對菌株進(jìn)行基因工程改造。有文獻(xiàn)報道了重組大腸桿菌在乳清中生產(chǎn)PHB的結(jié)果，利用乳清為碳源通過分批補(bǔ)料發(fā)酵的方式培養(yǎng)重組大腸桿菌，PHB濃度為69 g/L，產(chǎn)率為1.4 g/L/h[18]。Ahn等利用pH值穩(wěn)態(tài)監(jiān)測補(bǔ)料，維持培養(yǎng)體系中乳清的高濃度(280g/L)，最終菌體干重和PHB的產(chǎn)量分別為120 g/L和96 g/L[19]。Nikel等利用乳清和玉米漿作為碳源和氮源，在重組大腸桿菌中獲得了2.13 g/(L·h)的PHB產(chǎn)率[20]。

3.2　生物燃料來源的廢棄物

隨著生物燃料產(chǎn)量的迅速增加，副產(chǎn)品液相甘油(glycerol liquid phase，含70%的甘油)的產(chǎn)量也隨之增加。將該產(chǎn)物作為原料生產(chǎn)其他化合物既能提高生物柴油生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，也具有生態(tài)合理性。由于甘油可直接參與糖代謝和脂肪代謝，許多微生物菌株不需經(jīng)過脫脂或脫甲醇等純化步驟，即可利用液相甘油作底物生產(chǎn)PHA聚酯和乳酸[21]。但是當(dāng)加入甘油或乙二醇時，這些物質(zhì)會通過共價連接聚酯的羧基端而終止鏈的延長，減少PHA的分子量[22]。另外，液相甘油中殘存的甲醇也可能影響菌株的生長。

3.3　廢棄油脂和纖維素

廢棄油脂和纖維素可以作為碳源。能直接被微生物利用的廢油脂包括廢棄食用油、工業(yè)生產(chǎn)各種植物油/肉骨粉的廢油及廢水中的油脂。有人發(fā)現(xiàn)，羅氏真養(yǎng)菌能吸收未過濾的植物油脂廢物以及廢棄動物脂，轉(zhuǎn)換成PHA，且產(chǎn)量較高，與以葡萄糖作為碳源得到的產(chǎn)率相近[23]。蔗渣中的半纖維素和纖維素組分可以被微生物水解和用于PHA合成，Silva等以水解蔗渣為碳源，在發(fā)酵罐規(guī)模利用菌株BurkholderiasacchariIPT101合成PHA[24]。最終PHA占細(xì)胞干重的62%，結(jié)果優(yōu)于純糖碳源，但細(xì)胞密度相對較低[24]。利用此類碳源存在的問題是，自然界現(xiàn)有菌株往往難以兼顧碳源利用和PHA合成，需要進(jìn)行菌株改造，因此大腸桿菌是理想的出發(fā)菌株。

3.4　活性污泥

活性污泥法是最常用的污水處理法之一。在污水厭氧-好氧活性污泥處理過程或生物強(qiáng)化除磷過程中，微生物消耗多磷酸鹽作為能量來源，攝取碳源并以PHA的形式貯存，因此可以用活性污泥合成PHA。在厭氧-好氧活性污泥工藝中，微生物貯存的PHA最高可達(dá)細(xì)胞干重的67%[25]。采用活性污泥合成PHA不需要滅菌，實(shí)現(xiàn)了剩余活性污泥的資源化，有很大發(fā)展前景。

3.5　廉價氮源

在PHA的生產(chǎn)過程中，除了碳源，另一個關(guān)鍵的成本因素就是氮源。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加少量的氮源如硫酸銨，可以提高PHB產(chǎn)量。其他復(fù)合氮源也有相似的效果，如酵母提取物。復(fù)合氮源能供應(yīng)幾乎全部的氨基酸和多肽，可以很容易被細(xì)胞轉(zhuǎn)換合成自身的蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)是成分復(fù)雜，對PHA生產(chǎn)控制可能會帶來不利影響。

4總結(jié)與展望

由于有著優(yōu)良的材料學(xué)性質(zhì)及可降解屬性，PHA已成為前景廣闊的新一代生物塑料之一。以PHA為材料產(chǎn)品的生產(chǎn)以及廢棄物的降解過程完全無污染，不會給環(huán)境增添任何負(fù)擔(dān)。另外組成PHA的單體范圍廣闊，使其產(chǎn)品種類豐富，可滿足多種需求。

目前在生物安全和環(huán)境友好方面PHA已得到業(yè)界的普遍認(rèn)可，限制PHA大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的最主要因素在于其相對石化塑料較高的生產(chǎn)成本。PHA的成本主要包括，原料成本、生產(chǎn)能耗和提取加工三個方面。其中以原料成本為主。為降低成本實(shí)現(xiàn)PHA的工業(yè)化生產(chǎn)，需要努力從原料、生產(chǎn)、提取工藝等方面進(jìn)行優(yōu)化。這方面改進(jìn)的關(guān)鍵因素是獲得品質(zhì)優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。另一方面，利用其生物相容性和體內(nèi)降解特性，開發(fā)高附加值的新型PHA，拓展PHA材料在醫(yī)用和藥用領(lǐng)域的應(yīng)用成為PHA領(lǐng)域發(fā)展的新熱點(diǎn)。

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收稿日期2014-01-07