Ack-1和CDC42在胃癌組織中的表達和意義

※：青海省科技項目應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃(2012-Z-727)

郜茜(1975~)，女，漢族，青海籍，副主任醫(yī)師

Ack-1和CDC42在胃癌組織中的表達和意義

郜茜，盧永福，王昀，楊永成，蔣漢梅

(青海大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科)

摘要目的探討胃癌組織和癌旁組織中Ack-1、CDC42基因和蛋白的表達水平，了解兩者在胃癌組織中的表達特點和相關(guān)性及對胃癌臨床病理特點的影響。方法于胃癌病變處取2～4塊黏膜活檢，并在離癌旁大于5 cm處取正常組織1～2塊。采用實時定量PCR(real-time PCR)和免疫印記(Western-blot)法檢測胃癌組織和癌旁組織中Ack-1、CDC42基因和蛋白的表達量，并行相關(guān)分析。結(jié)果胃癌組織中Ack-1、CDC42 mRNA表達較癌旁組織明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，CDC42的表達與腫瘤浸潤深度有關(guān)(P<0.01)；Ack-1、CDC42的表達呈明顯正相關(guān)(r=0.481，P<0.01)。胃癌組織中Ack-1、CDC42蛋白量的表達也較癌旁組織明顯升高，分別為(2.44±0.45)vs(1.34±0.24)(t=4.349，P<0.05)和(2.81±0.45)vs(1.37±0.31)(t=4.755，P<0.05)。結(jié)論Ack-1、CDC42在胃癌組織中的表達明顯升高，其中CDC42和腫瘤的浸潤深度有關(guān)。Ack-1和CDC42的表達呈明顯正相關(guān)，提示二者在胃癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，有可能成為胃癌預(yù)后的判斷指標和治療靶點。

關(guān)鍵詞Ack-1CDC42熒光定量PCR免疫印跡胃癌

中圖分類號R735．2

文獻標識碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.008

AbstractObjectiveTo study the Ack-1and CDC42 expression in gastric cancer and its difference in the clinical and pathological features.Methods 42 cases of gastric cancer tissue confirmed by pathology and its adjacent normal tissue were collected.The expression of Ack-1 and CDC42 were evaluated by Real-time PCR and Western-blot.Results Both expression of Ack-1 and CDC42 in gastric cancer tissue were significantly increased compared with those in the adjacent normal tissue at the protein and mRNA level.The increased CDC42 was associated with local invasion in gastric carcinoma(P<0.01).And there was a positive correlation between the expression of CDC42 and Ack-1(r=0.481，P<0.01).Conclusion CDC42 and Ack-1 are obviously over expressed in gastric carcinoma tissue compared with those in the adjacent normal tissue at the protein and mRNA level，and there show a positive correlation between them.It is considered that they may play an important roles in the development and progression of gastric cancer，and may be a potential biomarkers for the prognosis and treatment of gastric cancer in the future.

KeywordsCDC42 Ack-1Real-timePCR Western-blotGastric cancer

收稿日期2015-02-04

EXPRESS AND SIGNIFICANCE OF CDC42 AND

Ack-1 IN GASTRIC CANCER

Gao Qian，Lu Yongfu，Wang Yun，Yang Yongcheng，Jiang Hanmei

(Department of Gastroenterology，The Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining，Qinghai 810001，China )

胃癌發(fā)病機制尚有許多未明之處。近年來Rho家族蛋白在腫瘤方面的作用受到人們重視，其中CDC42是一個具有代表性的小分子G蛋白，它在細胞骨架調(diào)節(jié)、細胞運動、細胞凋亡、細胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移等方面有重要作用[1-2]。Ack-1是CDC42下游的效應(yīng)原件，主要分布于胞漿的非受體酪氨酸激酶，具有催化底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化激活底物酶活性的功能。近年來，國內(nèi)外研究顯示，Ack-1的表達、激活與腫瘤的發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移等過程相關(guān)，但其在胃癌中的作用目前研究較少，且結(jié)論不一，Ack-1和CDC42在胃癌中的關(guān)系不明。本研究旨在通過實時定量PCR(real-time PCR)和蛋白免疫印跡(Western-blot)法檢測Ack-1和CDC42在胃癌組織中的表達，探討二者在胃癌組織中的表達特點及和胃癌臨床病理特點的關(guān)系。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1標本

選取青海大學附屬醫(yī)院2010～2011年經(jīng)胃鏡檢查并經(jīng)病理確診的胃癌患者42例，其中男性28例，女性14例，平均年齡(57.14±9.26)歲。入選患者無長期服用非甾體類抗炎藥歷史，檢查前均未接受化療、放療和生物治療。征得患者同意后，所有研究對象均接受胃鏡檢查及胃黏膜活檢術(shù)，在胃癌病變處取2～4塊黏膜，并在離癌旁>5 cm處取正常組織1～2塊作為癌旁組織。

1.1.2試劑

Ack-1、CDC42多克隆兔抗人抗體均購自Sigma公司；mRNA提取試劑Trizol購自Ambion公司；RT2 cDNA sysnthesis kit、RT2 SYBR qPCR mix和引物的合成均由Qiagen提供。RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自PRIECE公司；PVDF膜0.45μm購自Millipore公司。

1.2　實驗方法

1.2.1實時定量PCR

實時定量PCR：按說明書用Trizole提取組織總RNA(每50～100mg組織加Trizole試劑1mL)，取2 μL用DEPC水稀釋后測OD值，A260/A280在1.8～2.0之間，符合PCR反應(yīng)要求。按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，配制20 μL反應(yīng)體系合成cDNA。反應(yīng)條件設(shè)置為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反應(yīng)結(jié)束后置-20 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA進行熒光定量PCR檢測。CDC42、Ack-1和18s的引物均為美國Qiagen公司預(yù)制定量PCR專用引物，引物序號分別為QT00066528、QT01014181和QT00199367。將目的基因及管家基因在不同的反應(yīng)管中進行擴增， 反應(yīng)體系均為20 μL， 反應(yīng)條件：于95 ℃ 行2 min預(yù)變性后，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。ABI 5700型實時熒光定量PCR儀監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)， 結(jié)果根據(jù)標準曲線由軟件自動計算后得出。每組標本重復(fù)3次，取平均值為Ct值。用2-△△Ct法進行目的基因表達的相對定量?！鰿t值=目的基因Ct值﹣內(nèi)參基因Ct值，△△Ct=△Ct癌組織﹣△Ct癌旁組織。以癌旁組織目的基因表達量為1，2-△△Ct值即為胃癌組織中目的基因較癌旁組織中目的基因的表達倍數(shù)。

1.2.2免疫印跡

免疫印跡： RIPA蛋白裂解液裂解組織(每20mg組織加入100～200μL裂解液)提取蛋白，按BCA蛋白定量試劑盒說明書操作進行蛋白定量。10%分離膠進行SDS-PAGE電泳(150V，1.5h)，100 V電壓條件下轉(zhuǎn)膜90 min，用含脫脂奶粉的TBST溶液室溫下封閉1 h，一抗4 ℃下孵育過夜。用TBST溶液充分洗膜3次，10 min/次，然后加入相應(yīng)二抗，室溫下孵育1 h，TBST溶液洗膜3次，化學發(fā)光法顯影。Quantity One軟件進行目的蛋白及內(nèi)參灰度值分析，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值為所測目的蛋白的相對含量。

1.3　統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1　Ack-1、CDC42 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達

Ack-1、CDC42mRNA在胃癌組織中的表達均明顯高于癌旁組織的表達，差異有統(tǒng)計學意義(表1)，行相關(guān)性分析顯示Ack-1、CDC42 mRNA的表達具有明顯正相關(guān)性(圖1，r=0.481，P<0.01)

Table 1　The relative expression of Ack-1 and CDC42 mRNA in the gastric carcinoma and

surrounding normal tissues( ± s)

Table 1　The relative expression of Ack-1 and CDC42 mRNA in the gastric carcinoma and

例數(shù)胃癌旁組織胃癌組織tPAck-14211.32±0.67-3.081<0.01CDC424211.37±0.70-3.416<0.01

Figure 1　The correlation between Ack-1 and CDC42 mRNA

2.2　Ack-1、CDC42蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達

免疫印跡結(jié)果顯示，胃癌組織中Ack-1、CDC42蛋白量的表達較癌旁組織中明顯升高，分別為(2.44±0.45)vs(1.34±0.24)(t=4.349，P<0.05)和(2.81±0.45)vs (1.37±0.31)(t=4.755，P<0.05)(圖2)。

Figure 2　Expression of CDC42 and Ack-1 in the gastric carcinoma and surrounding normal tissues

2.3　Ack-1、CDC42的表達和胃癌臨床病理特點的關(guān)系

CDC42的表達與腫瘤浸潤深度有關(guān)(P<0.01)。而Ack-1、CDC42的表達均與年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期和腫瘤的分化程度無關(guān)(P>0.05)(表2)。

Table 2　Relationship between CDC42 and Ack-1 mRNA expression and the clinicopathological

staging in gastric cancer( ± s)

Table 2　Relationship between CDC42 and Ack-1 mRNA expression and the clinicopathological

臨床病理因素例數(shù)(n)CDC422-△△Ct值tPAck-12-△△Ct值tP年齡(歲) <50121.49±0.900.669>0.051.41±0.610.552>0.05 ≥50301.32±0.621.28±0.69性別 男281.33±0.77-0.502>0.051.32±0.76-0.034>0.05 女141.45±0.561.32+0.46

續(xù)表：

臨床病理因素例數(shù)(n)CDC422-△△Ct值tPAck-12-△△Ct值tP浸潤深度 T1+T2291.15±0.55-3.361<0.011.26±0.63-0.896>0.05 T3+T4131.86±0.791.46±0.74淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有281.37±0.76-0.039>0.051.33±0.680.109>0.05 無141.38±0.601.30±0.66TNM分期 Ⅰ+Ⅱ271.25±0.57-1.547>0.051.20±0.70-1.569>0.05 Ⅲ+Ⅳ151.59±0.881.53±0.57分化程度 低201.30±0.530.264※>0.051.20±0.590.613※>0.05 中161.41±0.831.41±0.84 高61.52±0.921.46±0.29

注：※為F值.

3討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移與細胞的遷移密切關(guān)系。其中Rho蛋白家族通過對細胞周期的進展、細胞的生存、生長、增殖和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)對腫瘤的生長起著重要作用[1]。CDC42是一種鳥嘌呤三核苷酸(GTP)酶，是Rho家族蛋白(RhoGTPase)中的一種，全稱為細胞分裂周期蛋白42(celldivisioncycle42)，在細胞骨架調(diào)節(jié)、細胞運動、細胞凋亡、細胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。CDC42表達增加可促進細胞分裂，加速細胞的生長和增殖，并能對抗和阻斷促進癌細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導途徑，最終促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3-5]。有研究探討了RhoA家族中5個重要蛋白RhoA、RhoB、RhoC、Rac1和CDC42在胃癌細胞系中的表達，與正常對照腸上皮細胞系相比，發(fā)現(xiàn)5種胃癌細胞系中CDC42 mRNA的表達均明顯上調(diào)[6]，提示CDC42在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起非常重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CDC42 mRNA和蛋白的表達均顯著升高，和癌旁組織相比具有統(tǒng)計學差異。同時發(fā)現(xiàn)CDC42 mRNA的表達量和腫瘤的浸潤深度有關(guān)，處于T1、T2期浸潤的胃癌組織中CDC42 mRNA表達量明顯低于T3、T4期腫瘤，但和患者年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤的分化程度等無關(guān)，提示了CDC42在胃癌對周圍組織的侵襲性致病中有很重要的作用。

Ack-l蛋白屬于酪氨酸激酶家族，最早是作為CDC42下游的作用蛋白被發(fā)現(xiàn)。作為CDC42下游的效應(yīng)器，Ack-1參與了多條CDC42介導的信號通路，在細胞增殖、腫瘤侵襲中有重要作用。Ack-1與多種組織來源的腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有研究表明，Ack-1通過抑制腫瘤抑制因子WWOX的活動，促進腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[6，7]。同時Ack-1基因在早期腫瘤和晚期腫瘤組織中存在差異表達，Ack-l在晚期腫瘤中的表達明顯高于早期腫瘤[7]，提示Ack-l在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起了很大作用。我們的研究結(jié)果顯示無論基因水平還是蛋白水平，Ack-1在胃癌組織中的表達都顯著高于癌旁組織。雖然我們的結(jié)果顯示Ack-1在腫瘤的浸潤深度、TNM分期等組間比較時無統(tǒng)計學差異，但在腫瘤浸潤的T3-T4期、TNM分期的Ⅲ-Ⅳ期較腫瘤浸潤的T1-T2期、TNM分期的Ⅰ-Ⅱ期，Ack-1基因表達仍有升高趨勢，在高分化組織中也較低分化組織中升高，提示Ack-1可能參與了胃癌的浸潤和分化過程。

Ack-l是CDC42的下游效應(yīng)器，二者在對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移可能起著一定的交互作用。在對黑色素瘤的研究中顯示Ack-l、CDC42和黑色素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)組成一個復(fù)合物，該復(fù)合物又進一步募集p130cas蛋白并使之發(fā)生酪氨酸磷酸化激活，從而促使黑色素瘤細胞發(fā)生運動遷移[8]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CDC42、Ack-1的mRNA表達水平呈明顯正相關(guān)，提示在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中二者的表達可能存在著一定的正反饋機制，最終加速了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，但這有待于進一步的深入研究。

我們的結(jié)果提示，Ack-1、CDC42在胃癌組織中的表達明顯升高，其中CDC42表達與腫瘤浸潤深度有關(guān)，而且CDC42、Ack-1表達呈明顯正相關(guān)，提示CDC42、Ack-1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，未來有可能會成為胃癌預(yù)后的判斷指標和治療靶點。

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