李騰達(dá),劉 鵬,谷明莉,鄧順江,吳林洪,葉 辛,劉 云,張薇薇,錢 琤,鄧安梅
(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院,上海 200433;2.解放軍100醫(yī)院,江蘇蘇州 215007)
免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)是一種自身免疫性疾病,其特點(diǎn)是針對(duì)自身抗體敏感的血小板清除加快,產(chǎn)生量相對(duì)不足,血小板總量減少[1]。在ITP中,激活的自身免疫性T細(xì)胞增多,IFN-γ,IL-2等Th1型細(xì)胞因子與IL-17等Th17型細(xì)胞因子增多,與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[2]。而在T細(xì)胞適應(yīng)性免疫過(guò)程中上游固有免疫Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)扮演了重要角色,它能夠在免疫系統(tǒng)受到病原體攻擊時(shí)快速識(shí)別一系列病原體相關(guān)模式分子[1]。ITP病人中TLRs信號(hào)通路的激活能增強(qiáng)促炎因子如IL-6,TNF-α等表達(dá),從而使機(jī)體更有利于調(diào)動(dòng)適應(yīng)性免疫過(guò)程[1]。
CD93(也叫C1qRp),是一種跨膜糖蛋白,表達(dá)于單核細(xì)胞、表皮細(xì)胞等細(xì)胞表面,溶解形式為sCD93,與細(xì)胞黏附和吞噬作用密切相關(guān)[3]。有報(bào)道顯示CD93能誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞,擴(kuò)大TLR通路反應(yīng)和促炎因子如TNF-α的產(chǎn)生[4]。近來(lái)CD93在自身免疫疾病中的作用逐漸突顯,在系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis,SSc)中,血清中sCD93升高,與TLR配體、TNF-α表達(dá)相關(guān)[5];在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)與骨關(guān)節(jié)炎的對(duì)照研究中,sCD93在RA中顯著上升,與疾病形成相關(guān)[4]。然而,在ITP中CD93的作用機(jī)制尚未明確,本文通過(guò)分析sCD93在病人血漿中的表達(dá)水平及其與TNF-α等細(xì)胞因子的相關(guān)性,為進(jìn)一步研究CD93在ITP疾病形成過(guò)程中的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。
1.1 研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組為34例2012年5月~2015年8月在上海長(zhǎng)海醫(yī)院血液科確診ITP患者,其中新診患者19例,慢性患者15例,男性14例,女性20例,平均年齡34.4±17.8歲。新診斷患者為新確診ITP病人,且之前無(wú)可靠的臨床或?qū)嶒?yàn)室確診證據(jù);慢性患者為已經(jīng)確診為ITP且持續(xù)12月以上的病人。對(duì)照組34例為同期體檢的健康個(gè)體,男性16例,女性18例,平均年齡36.8±18.9歲,兩組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有受試對(duì)象均簽署知情同意書。
1.2 試劑與儀器 ELISA試劑盒(美國(guó)eBioscience公司),酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司),生物分光光度計(jì)(德國(guó)Eppendorf公司),離心機(jī)(上海戴寶)。
1.3 方法
1.3.1 血漿收集及PBMC的分離:抽取研究對(duì)象2 ml左右的EDTA-K2抗凝無(wú)菌外周血,3 000 r/min離心10 min后,將血漿轉(zhuǎn)移至EP管中于-80℃凍存。
1.3.2 ELISA法檢測(cè)血漿sCD93及細(xì)胞因子的蛋白水平:按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行sCD93及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)。如下:每個(gè)反應(yīng)孔中加0.1 ml 1~10 μg/ml抗體稀釋液,4℃過(guò)夜。次日,棄孔內(nèi)液,洗滌,加0.1 ml適宜濃度的樣本于反應(yīng)孔中,37℃反應(yīng)1 h后洗滌。加入0.1 ml酶標(biāo)抗體,37℃,1 h后再洗滌。最后加TMB顯色,25 min后加2 mol/L硫酸終止反應(yīng),于450 nm處檢測(cè)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 兩組間連續(xù)性計(jì)量資料的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),sCD93與細(xì)胞因子的相關(guān)性以Pearson系數(shù)表示,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。統(tǒng)計(jì)軟件為GraphPad Prism 6.0。
2.1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血漿中sCD93的表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)組血漿中sCD93蛋白水平為367.28±206.98 ng/ml,對(duì)照組為218.43±96.14 ng/ml,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.803,P=0.000 3)。
2.2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞因子的表達(dá)水平 見表1。
表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞因子表達(dá)的比較
與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組血漿中TNF-α,IL-4,IL-17和IFN-γ蛋白表達(dá)量增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中TNF-α的表達(dá)量約為對(duì)照組的5倍,IFN-γ約為對(duì)照組的4倍,IL-4約為對(duì)照組的2倍。
2.3 實(shí)驗(yàn)組sCD93與細(xì)胞因子的相關(guān)性分析 實(shí)驗(yàn)組ITP患者血漿中sCD93與TNF-α,IL-17表達(dá)水平呈正相關(guān),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.448,0.473;均P<0.05);與IL-4,IFN-γ不具有相關(guān)性(r=0.198,0.245,均P>0.05)。
ITP是一種基因異質(zhì)性的血液疾病,不同群體有不同的致病原因、發(fā)病史和療效[1,6]。兒童ITP患者常有近期感染史[7],成人ITP則常伴有人類免疫缺陷病毒、幽門螺旋桿菌、丙肝病毒等慢性感染[1]。ITP疾病常常伴有Th1,Th2,Th17細(xì)胞亞群的失調(diào)和Tregs,Bregs細(xì)胞的免疫缺陷[1,2]。研究顯示ITP病人中,針對(duì)血小板自身抗原的T細(xì)胞分泌IL-2,IFN-γ增加,這表明CD4+T細(xì)胞群的分化趨向于Th1細(xì)胞亞群。此外,Th17細(xì)胞與IL-17產(chǎn)量也增加,表明Th17可能參與了ITP的免疫病理過(guò)程[2,7]。固有免疫中單核細(xì)胞被認(rèn)為是組織性巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的前身,在激活和極化自身免疫相關(guān)Th細(xì)胞方面有重要作用,實(shí)驗(yàn)表明去除CD16+單核細(xì)胞能升高Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞,抑制Th1細(xì)胞。在ITP中,CD16+單核細(xì)胞能促進(jìn)Th1細(xì)胞因子分泌,同時(shí)抑制Treg和Th17細(xì)胞[2]。而TLRs作為固有免疫反應(yīng)的哨兵,在連接固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起到了重要作用。最近有研究表明,血小板的TLRs能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞抗原提成,在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起到了重要作用,這表明在ITP等血小板相關(guān)性疾病中TLRs信號(hào)通路亦扮演了重要角色[1]。
CD93是一種跨膜糖蛋白,其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)包括C-型外源凝集素樣區(qū)域,系列EGF樣重復(fù)序列,高度糖基化黏蛋白樣區(qū)域,最近有研究表明CD93在調(diào)節(jié)凋亡細(xì)胞吞噬作用、維持組織穩(wěn)態(tài)和損傷修復(fù)方面有重要作用[8]。研究表明CD93在上皮細(xì)胞的表達(dá)與血管重建相關(guān),意味著其參與了血管重建過(guò)程,與急性炎癥、慢性炎癥反應(yīng)相關(guān)[9,10]。在以THP-1為模型的細(xì)胞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),CD93在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞之前能促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生[4]。在試管試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),TNF-α或LPS的刺激能導(dǎo)致CD93從單核細(xì)胞釋放成為sCD93,而sCD93能擴(kuò)大TLR介導(dǎo)的單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子,從而提高單核細(xì)胞TLR通路的敏感度[5],更有利于機(jī)體調(diào)動(dòng)適應(yīng)性免疫過(guò)程[1]?;贑D93在免疫調(diào)節(jié)方面的作用,其在自身免疫如SSc,RA中亦備受關(guān)注,然而其在ITP中的作用機(jī)制尚不明確,本研究發(fā)現(xiàn)sCD93在ITP中上升,且與IL-17,TNF-α呈正相關(guān),證明其可能參與了ITP的免疫性致病過(guò)程,但本實(shí)驗(yàn)樣本均來(lái)自同一地區(qū),且樣本例數(shù)較少,有待擴(kuò)大樣本進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證和深入研究。
[1] Lazarus AH,Semple JW,Cines DB.Innate and adaptive immunity in immune thrombocytopenia[J].Seminars in Hematology,2013,50(Suppl 1):S68-S70.
[2] Yazdanbakhsh K,Zhong H,Bao W.Immune dysregulation in immune thrombocytopenia[J].Seminars in Hematology,2013,50(Suppl 1):S63-S67.
[3] Sigari N,Jalili A,Mahdawi L,et al.Soluble CD93 as a novel biomarker in asthma exacerbation[J].Allergy Asthma & Immunology Research,2016,8(5):461-465.
[4] Jeon JW,Jung JG,Shin EC,et al.Soluble CD93 induces differentiation of monocytes and enhances TLR responses[J].Journal of Immunology,2010,185(8):4921-4927.
[5] Yanaba K,Asano Y,Noda S,et al.Augmented production of soluble CD93 in patients with systemic sclerosis and clinical association with severity of skin sclerosis[J].The British Journal of Dermatology,2012,167(3):542-547.
[6] 葉 辛,石 磊,谷明莉,等.原發(fā)性免疫性血小板減少癥患者顆粒溶素、顆粒酶B、穿孔素的表達(dá)及臨床意義[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,29(1):20-23.
Ye X,Shi L,Gu ML,et al.Expression of granzyme B,granulysin and perforin from patients with primary immune thrombocytopenia[J].Journal of Modern Laboratory Medicine,2014,29(1):20-23.
[7] Price V.Auto-immune lymphoproliferative disorder a-nd other secondary immune thrombocytopenias in childhood[J].Pediatric Blood & Cancer,2013,60(Suppl 1):S12-S14.
[8] Greenlee-Wacker MC,Galvan MD,Bohlson SS.CD9 3:recent advances and implications in disease[J].Current Drug Targets,2012,13(3):411-420.
[9] Liu C,Cui Z,Wang S,et al.CD93 and GIPC expression and localization during central nervous system inflammation[J].Neural Regeneration Research,2014,9(22):1995-2001.
[10] Galvagni F,Nardi F,Maida M,et al.CD93 and dystroglycan cooperation in human endothelial cell adhesion and migration adhesion and migration[J].Oncotarget,2016,7(9):10090-10103.