尿液HCMV DNA檢測(cè)在兒童HCMV感染中的臨床應(yīng)用*

張 華，詹 頡，趙 海，蘇寶鳳，蒼金榮，宮艷艷，劉培培，楊瑞雪

(陜西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710068)

人巨細(xì)胞病毒(HCMV)屬皰疹病毒科，其感染人體后使感染細(xì)胞腫大并產(chǎn)生巨大的核內(nèi)嗜酸性包涵體故稱為巨細(xì)胞病毒。人群對(duì)CMV普遍易感，但大多數(shù)免疫正常個(gè)體出現(xiàn)無(wú)癥狀感染，而新生兒和嬰幼兒因抵抗力較弱，感染后可出現(xiàn)明顯癥狀?，F(xiàn)對(duì)我院2014年1月～2015年12月收集的1 492例尿液標(biāo)本HCMV DNA結(jié)果進(jìn)行回顧性分析研究，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年1月～2015年12月本院兒科及新生兒科住院的疑似人巨細(xì)胞病毒感染的患兒尿液標(biāo)本1 492例，年齡0～12歲，其中新生兒(0～3月)78例，嬰幼兒(3月～3歲)981例，學(xué)齡前兒童(3～6歲)249例，學(xué)齡期兒童(6～12歲)184例；收集的標(biāo)本保存于4℃冰箱，48h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀采用美國(guó)通用公司ABI 7500全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀，按要求對(duì)儀器定期校驗(yàn)和維護(hù)；HCMV DNA檢測(cè)試劑盒由上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司提供，有生產(chǎn)許可證及嚴(yán)格的防污染技術(shù)。實(shí)驗(yàn)全過(guò)程遵守臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范，實(shí)驗(yàn)操作人員要求持證上崗，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行操作。

1.3 檢測(cè)原理 本品選取人巨細(xì)胞病毒株高度保守的非編碼區(qū)為擴(kuò)增的靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)尿液樣本中人巨細(xì)胞病毒DNA。

1.4 檢測(cè)方法 尿液混合均勻取1 000 μl，13 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀中加入1 000μl生理鹽水重新懸浮，13 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀中加入50 μl裂解液，混勻后100℃加熱10 min，13 000 r/min離心2 min，取4 μl上清液作為模板加入PCR反應(yīng)液上機(jī)擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)：50℃ 2 min；94℃ 5 min；再按94℃ 10s～60℃ 45 s循環(huán)40次，60℃采集熒光。

1.5 結(jié)果判斷 在陰陽(yáng)性對(duì)照和室內(nèi)質(zhì)控合格的情況下，Ct值小于38為陽(yáng)性，Ct值大于40為陰性，對(duì)Ct值介于38～40的灰區(qū)標(biāo)本按要求復(fù)檢，如檢測(cè)結(jié)果仍介于38～40之間則判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)數(shù)資料應(yīng)用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以a=0.05為水準(zhǔn)，即P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

見(jiàn)表1、表2。新生兒組、嬰幼兒組、學(xué)齡前組和學(xué)齡期組各種疾病時(shí)HCMV DNA檢測(cè)結(jié)果之間比較χ2=9.253～23.452，P均<0.01。其中學(xué)齡期組與新生兒組比較χ2=23.452，P<0.001，差異有顯著或非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而表2的患兒幾種常見(jiàn)疾病組中，肝功能異常組、支氣管肺炎組和發(fā)熱組之間χ2=0.356～0.865，P均>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而這三組與早產(chǎn)兒組和高膽紅素血癥組比較χ2=13.231，P均<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各年齡段HCMV DNA陽(yáng)性的分布

表2 患兒常見(jiàn)疾病HCMV DNA陽(yáng)性分布(n=1 482)

3 討論

人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)為臨床常見(jiàn)的病原體，是新生兒和嬰幼兒最常見(jiàn)的感染性疾病之一，其感染情況的臨床表現(xiàn)多樣化，幾乎覆蓋所有的重要器官，包括肺、肝、腎臟、骨髓、唾液腺、心臟和大腦，免疫力低下的患兒甚至引起多臟器損害[2]。在美國(guó)HCMV的感染率約為50%～70%，但是在發(fā)展中國(guó)家其感染率超過(guò)90%。在我國(guó)CMV抗體陽(yáng)性率90%以上，即90%以上人群感染過(guò)CMV，大多數(shù)為無(wú)癥狀潛伏感染[3]。盡管HCMV在健康人群中基本無(wú)致病性，但是先天感染HCMV可導(dǎo)致新生兒神經(jīng)系統(tǒng)缺陷，特別是免疫系統(tǒng)尚未成熟的新生兒初始和反復(fù)感染HCMV可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病如肺炎、肝炎以及胃腸道相關(guān)疾病。

本結(jié)果顯示在HCMV DNA陽(yáng)性的291例患兒中，新生兒的HCMV-DNA陽(yáng)性率最高(38.5%)，其次為嬰幼兒(22.0%)，即隨著年齡的遞增HCMV DNA陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)，到學(xué)齡期兒童的感染率最低(4.9%)，各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01或P<0.001)。說(shuō)明HCMV感染與患兒的年齡和免疫狀態(tài)密切相關(guān)，新生兒由于免疫系統(tǒng)尚未健全HCMV DNA陽(yáng)性率較高，3歲以后逐漸下降，即隨著年齡的增長(zhǎng)自身免疫系統(tǒng)逐漸完善，其HCMV的感染率逐漸下降，在學(xué)齡期兒童的感染率降為最低。新生兒的高感染率說(shuō)明CMV感染途徑主要為宮內(nèi)感染和圍產(chǎn)期感染，出生后感染次之。然而在孕婦原發(fā)或繼發(fā)感染后，病毒通過(guò)胎盤(pán)直接感染胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞，而后到胎兒體內(nèi)引起宮內(nèi)感染[4，6]是新生兒高感染率的主要因素；而圍產(chǎn)期感染可能經(jīng)產(chǎn)道和母乳等途徑獲得。

在不同疾病組中，早產(chǎn)兒和高膽紅素血癥患兒的HCMV DNA陽(yáng)性率最高(分別為43.5%和38.2%)，與其他組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.01)，其余各組(肝功能異常、支氣管肺炎患兒和發(fā)熱等)之間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。早產(chǎn)兒和高膽紅素血癥的HCMV高感染率基本和患兒的年齡有關(guān)，因?yàn)楦吣懠t素血癥的患兒基本都是新生兒，但是高感染率的HCMV是否導(dǎo)致胎兒的早產(chǎn)還有待于進(jìn)一步研究。肝功異常、支氣管肺炎和發(fā)熱均有一定的HCMV感染率，這可能與HCMV感染導(dǎo)致全身多器官多系統(tǒng)損害，特別是累及肝臟和肺臟，其特點(diǎn)與有關(guān)報(bào)道相符合[5]。不過(guò)由于HCMV宮內(nèi)感染引起胎盤(pán)功能出現(xiàn)異常，患兒缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致一系列代償反應(yīng)而導(dǎo)致早產(chǎn)，HCMV容易侵犯管道上皮細(xì)胞故引起患兒高膽紅素血癥、支氣管肺炎和肝功能損害，但HCMV感染是否可直接導(dǎo)致患兒高膽紅素血癥和肝功損害其機(jī)制仍處于推測(cè)階段，尚需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示新生兒和嬰幼兒是人巨細(xì)胞病毒感染的高發(fā)人群，其中的早產(chǎn)兒和高膽紅素血癥患兒的HCMV DNA檢出率高應(yīng)引起重視。目前HCMV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法較多，而HCMV DNA陽(yáng)性是HCMV感染最直接的證據(jù)。而該研究利用回顧性分析方法，采用FQ-PCR技術(shù)檢測(cè)1 492例疑似人巨細(xì)胞病毒感染的患兒尿液樣本中的HCMV DNA，總檢出率為19.5%(291/1 492)，低于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的30%～40%，原因可能是本研究中統(tǒng)計(jì)樣本時(shí)去除了反復(fù)檢測(cè)的患兒，而且尿液樣本的留取和保存影響因素較多，也不能排除地域差異。研究顯示不同的樣本類型會(huì)對(duì)FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果有直接影響，但是由于尿液樣本簡(jiǎn)單易得，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)靈敏度高，特異性強(qiáng)，特別是對(duì)于新生兒嬰幼兒采集尿液樣本比采集血液等相關(guān)樣本更為快捷和方便，而且患兒無(wú)創(chuàng)傷，因此尿液HCMV DNA檢測(cè)對(duì)患兒HCMV感染及相關(guān)疾病的診斷和治療具有重要意義。

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