血清miRNA-186，miRNA-30c在肝細胞性癌中診斷價值的研究*

劉 沖，唐 浩，鄧 霖，張 靜，鄧建平(黃石市愛康醫(yī)院有限責任公司檢驗科，湖北黃石 435000)

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第五大常見腫瘤，在腫瘤相關死亡中排第三位，我國肝癌患者占世界范圍內(nèi)罹患肝癌患者總數(shù)的一半以上[1]，目前診斷肝癌主要是依靠影像學證據(jù)的基礎上結合臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結果來診斷肝癌，以血清甲胎蛋白(AFP)和異常凝血酶原(DCP)為主的實驗室診斷肝癌的指標存在著敏感度和特異度低的特點[2]。微核糖核酸(microRNA, miRNA)是一種內(nèi)源性的非編碼單鏈小RNA，在進化上高度保守，可以通過抑制或降解靶基因mRNA從而達到抑制靶基因的作用[3]。研究表明多種miRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，對這類與肝癌相關的miRAN 檢測在早期肝癌的診斷中有著重要的診斷學意義[4]。本研究選取在肝癌患者血清中表達的miRNA-186和miRNA-30c作為研究對象，對其表達進行檢測，并與血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)的表達水平進行比較分析，以探討它們在HCC診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集黃石市愛康醫(yī)院外科及腫瘤科2013年6月～2015 年2月的HCC住院患者血清55例，其中男性38例，女性17例，年齡36～77歲，平均年齡56.4±8.1歲；高分化10例，中分化20例，低分化25例；腫瘤直徑≥5 cm者30例，<5 cm者25例。所有病例術后病理檢查證實為HCC，診斷標準符合中華醫(yī)學會2012版《肝癌規(guī)范化診治指南》。收集慢性乙型肝炎(chronic hepatitisB，CHB)患者血清55例，均來自黃石市愛康醫(yī)院感染科。所有患者的臨床診斷符合中華醫(yī)學會2010版《慢性乙型肝炎防治指南》標準。所有患者均簽署知情同意書。另選55例健康人血清作為健康對照(normal control，NC)，且無重要器官疾病史，谷氨酸氨基轉移酶均正常。本實驗過程嚴格遵守赫爾辛基宣言的倫理要求。

1.2 試劑和儀器 血漿樣本總RNA提取試劑盒(BLOODmisi試劑盒，Aidlab，中國)；Trizol LS(Invitrogen，美國)；反轉錄試劑盒(miRcute miRNA cDNA提取分離試劑盒，TIANGEN，中國)；定量PCR試劑盒(miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒，TIANGEN，中國)；Rotor-Gene Q 實時熒光定量PCR儀(QIAGEN，德國)；高速冷凍離心機Z300K(HERMLE，德國)。

1.3 方法 用Trizol法提取血液樣本按一定比例加入Trizol提取總mRNA，按照miRNeasy mini kit試劑盒說明書步驟完成提取，獲得的RNA溶解于200 μl RNase-free ddH2O中備用。在GenBank查找基因序列，使用軟件Primer-Express 2.0進行引物的設計，并參考結合相關文獻。其中以RNU6B作為內(nèi)參引物，其上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-186上游引物為5’-CCCGATAAAGCTAGATAACC-3’，下游引物為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；miR-30c上游引物為5’-GCCGCTGTAAACATCCTACACT-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。miRNA逆轉錄按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書步驟進行。熒光定量PCR按照miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書進行檢測。反應體系為20 μl，包括第一鏈合成cDNA，miRcute miRNA premix及引物。反應條件：94℃預變性2 min；然后94℃15 s,60℃30 s，進行30～40個循環(huán)反應。以RNU6B作為內(nèi)參。血清miR-186，miR-30c相對表達量計算公式為RQ=2-△△Ct[5]。每個樣品以3次重復測定取平均值，同時做空白組以提高實驗可靠性。

2 結果

2.1 miR-186，miR-30c在肝癌、慢性肝炎及健康對照者中的表達 miR-186在肝癌患者、慢性肝炎患者以及健康體檢者血清中相對表達量分別為9.16±3.20，7.71±2.33，4.38±1.21，肝癌患者血清中miR-186的表達高于慢性肝炎患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，同時高于健康體檢者，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.02)；miR-30c在肝癌患者、慢性肝炎患者以及健康體檢者血清中相對表達量分別為1.02±0.26，1.44±1.17，2.46±1.00，miR-30c在肝癌患者血清中的表達低于健康體檢者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；miR-30c在肝癌患者血清中低于肝炎患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.034)。

2.2 血清miR-186，miR-30c與肝癌病理學指標的關系 見表1。血清miR-186的相對表達水平與腫瘤患者的性別、年齡、是否HbsAg陽性、腫瘤直徑、腫塊個數(shù)、AFP濃度、腫瘤分化程度、是否并發(fā)肝硬化、是否侵犯血管以及腫瘤的TMN分期病理指標無關，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；肝癌并發(fā)肝硬化患者血清miR-30c相對表達量高于無肝硬化的肝癌患者，二者差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.807，P=0.07)，miR-30c的相對表達量與其它肝癌病理因素均無關(P>0.05)。

2.3 miR-186，miR-30c，AFP診斷肝癌的ROC曲線分析 對肝癌患者血清miR-186，miR-30c，AFP相對表達量進行ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)miR-186的ROC曲線下面積AUC為0.927，95%可信區(qū)間為0.880～0.974，P<0.000 1，診斷肝癌臨界值為6.39；miR-30c的ROC曲線下面積AUC為0.932，95%可信區(qū)間為0.883～0.981，P<0.000 1，診斷肝癌臨界值為1.260；而AFP的ROC曲線下面積AUC為0.838，95%可信區(qū)間為0.766～0.909，P<0.000 1，診斷肝癌臨界值為34.79。

表1 miR-186，miR-30c相對表達量與肝癌病理學指標關系(2-△△Ct)

2.4 miR-186，miR-30c，AFP診斷肝癌的單獨或聯(lián)合診斷肝癌的效力分析 根據(jù)ROC曲線，三者的診斷效力見表2。三指標兩兩聯(lián)合及三者同時聯(lián)合時的診斷敏感度均較單一指標有所升高，而特異度有所下降。其中miR-30c與AFP聯(lián)合檢測時在顯著提升診斷敏感度的同時，特異度仍維持在較好水平，且準確度也相對最高。

表2 miR-186，miR-30c，AFP單獨或聯(lián)合診斷肝癌效力比較[%(n)]

3 討論

肝癌具有高度轉移性和復發(fā)性且對化療不敏感等特點，目前治療肝癌最有效的手段是手術切除，肝癌發(fā)病具有隱匿性和發(fā)展迅速的特點，通過影像學發(fā)現(xiàn)的肝癌多數(shù)已處于晚期，因而失去了最佳的手術時機[6]。目前除影像學診斷肝癌，實驗室主要通過檢測血清AFP來輔助診斷，臨床認為血清AFP>400 ng/ml即可臨床診斷為肝癌，但是如果以此為陽性閾值，則將有近三分之一的早期肝癌(直徑<3cm)患者將被漏診[7]。臨床上血清AFP在肝炎患者及肝硬化患者中表達也會升高，嚴重影響AFP診斷肝癌的準確性，尋找一種便捷準確的診斷肝癌的血清學方法已經(jīng)成為了臨床的迫切需要。近年來研究發(fā)現(xiàn)許多體循環(huán)miRNA異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，在腫瘤患者體內(nèi)某些miRNA呈現(xiàn)異常表達，這類miRNA可以直接或者間接參與某些癌基因表達調(diào)控，在腫瘤發(fā)生過程中調(diào)控細胞的增殖、凋亡、侵襲以及轉移等多個信號通路和分子，且循環(huán)血中miRNA穩(wěn)定性較好，便于檢測[8]。肝癌患者血清中多種miRNA表達異常，某些miRNA在肝癌患者血清中表達上調(diào)，如miR-223，miR-885，miR-18[9，10]，而miRNA在肝癌患者血清中下調(diào)，如miR-16，miR-30c，miR-92a[11，12]。本研究選取在肝癌患者血清中高表達的miR-186和低表達的miR-30c作為研究對象，miR-186是一個新發(fā)現(xiàn)的分子，位于染色體1p31.1，可以通過影響P53信號通路影響多種腫瘤的細胞周期而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長，在肝硬化及肝癌癌前病變中表達上調(diào)，通過靶向調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因AKAP12表達而影響腫瘤細胞生長[13]；miR-30c屬于miR-30家族成員之一，miR-30c可以通過下調(diào)轉移相關基因1(MTA1)來影響腫瘤細胞增殖，與HMBOX1轉錄因子的3’非翻譯區(qū)結合使NKL細胞表膜的mTNF-α表達升高，從而使NK細胞的殺傷力增加來抑制肝癌的發(fā)展[14]。國內(nèi)外未見肝癌患者血清miR-186和miR-30c表達與肝癌病理學參數(shù)的相關性研究。本研究目的在于探討二者與肝癌病理學指標的關聯(lián)情況以及其在肝癌診斷中的意義。

本研究利用定量逆轉錄PCR技術檢測了肝癌、慢性肝炎及健康體檢者血miR-186和miR-30c的相對表達量，結果顯示肝癌患者血miR-186表達明顯高于慢性肝炎和健康體檢者，而miR-30c表達明顯低于慢性肝炎和健康體檢者。肝癌患者miR-30c的相對表達量與患者并發(fā)肝硬化相關，除此外miR-186和miR-30c與患者血AFP質量濃度、腫瘤大小、分化程度及是否肝外轉移等無明顯相關性。ROC工作曲線顯示以miR-186和miR-30c作為診斷標志物與血清AFP診斷HCC相比較，這兩種microRNA在具有較高特異性的同時，對HCC的診斷靈敏度均明顯優(yōu)于血清AFP，是獨立于AFP的潛在HCC診斷標志物，另外通過聯(lián)合檢測診斷肝癌，綜合敏感度、特異度及準確度來看，其中miR-30c與AFP聯(lián)合診斷是較為理想的肝癌診斷組合。而miR-186單獨或聯(lián)合其他兩項指標時的診斷特異度均不高，會造成不必要的誤診，增加被檢者的心理負擔，故認為其作為肝癌的診斷指標價值有限。

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