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    超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中的恩諾沙星和喹乙醇藥物的含量

    2016-01-10 02:56:06李洪波許小友黃志偉劉利曉羅志忠
    飼料工業(yè) 2016年22期
    關(guān)鍵詞:恩諾沙星乙腈

    ■李洪波 許小友 黃志偉 劉利曉 羅志忠

    (駐馬店市畜牧局,河南駐馬店 463000)

    恩諾沙星(Enrofloxacin)又名乙基環(huán)丙沙星,是第三代喹諾酮類(Quinolones,QNs)抗菌藥,具有抗菌譜廣、殺菌作用強(qiáng)、副作用小,與其他抗菌藥物交叉耐藥等特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床[1]。但是不合理使用恩諾沙星導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加[2],嚴(yán)重威脅人體健康。喹乙醇(Olaquindox)又名喹酰胺醇,屬于喹噁啉類藥物,是一類喹噁啉-1,4-二氧化物,能抗菌,促進(jìn)蛋白質(zhì)同化,增加瘦肉率而被廣泛使用[3]。但是毒理學(xué)研究表明,喹乙醇具有致癌、致畸等毒性[4]。飼料生產(chǎn)過程中非法添加和養(yǎng)殖者在養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,因此為保證動(dòng)物飼料安全,進(jìn)而保障畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全,有必要建立恩諾沙星和喹乙醇檢測(cè)方法。目前,關(guān)于恩諾沙星和喹乙醇的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法分別都有報(bào)道[5-8],但同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星和喹乙醇的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)分析法未見報(bào)道。本文建立了同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星和喹乙醇的超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法。該方法靈敏度高,選擇性好,為快速、嚴(yán)格地檢測(cè)監(jiān)管飼料中恩諾沙星和喹乙醇的違規(guī)使用和非法添加情況提供技術(shù)保障。

    1 材料和方法

    1.1 儀器

    Acquit UPLC-Xevo TQ-S質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters公司);3-30k臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司);TTLDCⅡ氮吹儀(北京同泰科技發(fā)展有限公司);IKAMS3.Basic圓周振蕩器(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司);AG125電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司);Waters Oasis HLB固相萃取柱(3CC/60 mg)。

    1.2 試劑

    甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉均為分析純;試驗(yàn)用水為經(jīng)mili-Q凈化系統(tǒng)制備的去離子水;恩諾沙星、喹乙醇購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

    Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液:分別稱取檸檬酸12.9 g、磷酸氫二鈉10.9 g、乙二胺四乙酸二鈉37.2 g,加水900 ml溶解,用1 mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0±0.5,加水稀釋至1 000 ml,即得。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制

    分別精密稱取恩諾沙星和喹乙醇各約10 mg,置于10 ml量瓶中,用甲醇溶解并稀釋成約1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。于-20℃下避光保存,然后用30%乙腈逐步稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    1.4 樣品前處理

    1.4.1 樣品提取

    稱取飼料試樣2.00 g(精確到0.01g),置于50 ml離心管內(nèi),加1%甲酸-乙腈(20∶80,V/V)10 ml,渦旋混勻2 min,超聲10 min,10 000 r/min離心5 min,轉(zhuǎn)移上清液于另一50 ml離心管內(nèi)。將余下部分重復(fù)提取一次,合并提取液。準(zhǔn)確量取提取液5ml于10 ml試管中,50℃氮?dú)獯抵良s1 ml,加入Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液2 ml,渦旋混勻1 min,為待凈化溶液。

    1.4.2 樣品凈化

    取HLB固相萃取柱,依次用3 ml甲醇和3 ml Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液活化。待凈化液全部過柱,依次用3 ml水和3 ml 5%甲醇淋洗,擠干。用3 ml甲醇洗脫,收集洗脫液,50℃氮?dú)獯蹈?,加? ml 30%乙腈水溶液溶解成凈化液,稀釋10倍后(取凈化液0.1 ml,加入30%乙腈水溶液0.9 ml),過0.22 μm濾膜后供超液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。

    1.5 方法

    1.5.1 色譜條件

    色譜柱:Waters Acquity UPLCTMBEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);柱溫:40 ℃;流動(dòng)相A:0.1%甲酸溶液,B:乙腈;進(jìn)樣量:2 μl;梯度洗脫程序見表1。

    表1 色譜梯度洗脫程序

    1.5.2 質(zhì)譜條件

    電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM;離子源溫度:150℃;霧化溫度:500℃;霧化器流速:1 000 L/Hr;錐孔氣流速:150 L/Hr;毛細(xì)管電壓:2.5 kV;定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

    表2 恩諾沙星和喹乙醇定性、定量離子及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量

    2 結(jié)果

    2.1 線性關(guān)系

    精密吸取200 μg/l的標(biāo)準(zhǔn)混合中間液0.025、0.05、0.10、0.20、0.50 ml于1.5 ml離心管中,分別加入0.1 ml空白凈化液,分別加入30%乙腈水溶液溶0.88、0.85、0.80、0.70、0.40 ml,渦旋混勻,從而配制成5、10、20、50、100 μg/l的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,并依次上機(jī),以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),定量離子的質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表3),可以看出7種化合物在5~100 μg/l范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均在0.998 0以上。

    表3 恩諾沙星和喹乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

    2.2 檢測(cè)限和定量限

    向空白飼料試樣中添加適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)處理上機(jī)。根據(jù)特征質(zhì)量色譜峰的信噪比S/N>3為檢測(cè)限,S/N>10為定量下限,檢測(cè)到恩諾沙星、喹乙醇的檢測(cè)限為0.05 mg/kg,定量下限為0.1 mg/kg。

    2.3 方法的靈敏度和準(zhǔn)確度

    分別在配合飼料、預(yù)混合飼料、濃縮飼料中添加0.1、0.2、0.5 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行回收率試驗(yàn),每個(gè)濃度做5個(gè)平行,連續(xù)做3批,其平均回收率、批內(nèi)(批間)變異系數(shù)見表4、表5、表6。恩諾沙星的回收率在80%~90%之間,喹乙醇的回收率在70%~90%,批內(nèi)批間的相對(duì)偏差均小于20%。恩諾沙星和喹乙醇在空白配合飼料中空白色譜圖見圖1,空白配合飼料添加色譜圖見圖2。

    表4 配合飼料中恩諾沙星和喹乙醇的回收率及RSD(n=5)

    表5 預(yù)混合飼料中恩諾沙星和喹乙醇的回收率及RSD(n=5)

    表6 濃縮飼料中恩諾沙星和喹乙醇的回收率及RSD(n=5)

    該試驗(yàn)方法靈敏度較好,準(zhǔn)確度高,滿足《獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》的相關(guān)要求。

    3 討論與小結(jié)

    3.1 色譜條件的優(yōu)化

    恩諾沙星具有兩性基團(tuán),屬于酸堿兩性化合物,在水溶液中以離子形式存在,通常選用酸性溶液作為流動(dòng)相組成成分[9]。喹乙醇已有報(bào)道,采用甲醇-水和乙酸-乙腈作為流動(dòng)相系統(tǒng)[10]。在使用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,粒徑1.7 μm)作為色譜柱條件下,分別嘗試了甲酸、乙酸、甲醇、乙腈多種配比流動(dòng)相條件,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相能獲得較好的峰型和較高的響應(yīng)。

    3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    首先分別將恩諾沙星(100 ng/ml)和喹乙醇(200 ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)溶液流動(dòng)注射進(jìn)樣,以正離子模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜圖掃描,發(fā)現(xiàn)這些藥物的[M+H]+峰均比較強(qiáng),故選擇[M+H]+作為母離子。然后進(jìn)行子離子掃描,最終分別選擇響應(yīng)值較高的兩個(gè)子離子作為定性和定量離子,并優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù),使其相應(yīng)的響應(yīng)值達(dá)到最大。

    3.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

    由于飼料樣品中基質(zhì)成分比較復(fù)雜,油脂類成分含量高,提取目標(biāo)化合物帶有堿性基團(tuán),故采用酸化有機(jī)提取溶液。經(jīng)過多次試驗(yàn)最終確定用1%甲酸-乙腈(20∶80,V/V)溶液作為提取液回收率最好。固相萃取柱的選擇對(duì)樣品溶液的凈化,進(jìn)而減輕基質(zhì)效應(yīng)至關(guān)重要。本文分別對(duì)MCX、PCX、C18和HLB固相萃取柱進(jìn)行了考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLB柱回收率較高,批內(nèi)變異系數(shù)相對(duì)較小,最終選擇HLB柱作為凈化柱。同時(shí)對(duì)淋洗條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用水和5%甲醇淋洗都有較大的基質(zhì)干擾,采用10%甲醇淋洗,恩諾沙星和喹乙醇的的回收率明顯降低;因此采用依次用水和5%甲醇淋洗,甲醇洗脫,最終得到了滿意的試驗(yàn)結(jié)果。

    圖1 空白配合飼料恩諾沙星和喹乙醇特征離子質(zhì)量色譜圖

    圖2 空白配合飼料中添加0.2 mg/kg的恩諾沙星和喹乙醇特征離子質(zhì)量色譜圖

    由于不同種類的飼料其組成成分不同,導(dǎo)致樣品溶液的基質(zhì)不同,從而在儀器檢測(cè)過程中產(chǎn)生本不同的基質(zhì)效應(yīng)。本研究采用同種空白飼料做添加回收試驗(yàn)?zāi)艿玫綕M意結(jié)果,但不同種類空白飼料偏差較大。本研究將恩諾沙星和喹乙醇作為目標(biāo)化合物進(jìn)行試驗(yàn)探索,同時(shí)優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件、色譜條件和質(zhì)譜條件,從而建立了飼料中同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星和喹乙醇的UPLC-MS/MS方法,并且其準(zhǔn)確度和靈敏度能滿足飼料檢測(cè)的需要。恩諾沙星和喹乙醇是喹諾酮類和喹噁啉類藥物的典型代表。該方法的建立為喹諾酮類和喹噁啉類更多藥物同時(shí)進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測(cè)的方法研究奠定基礎(chǔ),具有一定的創(chuàng)新性和參考價(jià)值。

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