殼寡糖對仔豬兩種免疫器官酶活力的影響

■劉美思 王秀武 許青松 程立坤 尹 恒

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所天然產(chǎn)物及糖工程試驗室，遼寧大連 116011；2.遼寧師范大學(xué)，遼寧大連 116021；3.大連海洋大學(xué)，遼寧大連 116023)

仔豬的免疫能力是養(yǎng)殖者十分關(guān)注的問題。學(xué)者們通常對仔豬免疫器官[1]、血清[2]或腸道免疫系統(tǒng)[3-4]進(jìn)行考察，評價其免疫作用。許多仔豬會因免疫力低下而早夭，對飼養(yǎng)者的經(jīng)濟等造成巨大損失。因此，如何有效且健康地提升仔豬的免疫能力，成為畜牧業(yè)關(guān)注的熱點之一。功能性寡糖作為天然、健康的飼料添加劑在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的使用日趨廣泛。有研究指出，飼料中添加4%的果寡糖可以用于提升斷奶仔豬的增重，改善腸道功能[5]。也有研究指出，飼料中添加寡糖，對斷奶仔豬的生長性能[6]、免疫能力[7]、腸道菌群及消化[8-9]等均有良好的調(diào)節(jié)作用。Che等(2012)[10]通過豬的體內(nèi)和體外試驗研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖可以作為免疫調(diào)節(jié)劑直接激活巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，也可以降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的過度表達(dá)，對宿主的防御和避免有害的過度刺激具有重要作用。

胸腺和脾臟是重要的免疫器官。脾臟中包含著眾多免疫細(xì)胞，而T細(xì)胞在胸腺中成熟。在考察動物免疫力的高低時，胸腺、脾臟的質(zhì)量及指數(shù)經(jīng)常作為重要的參考指標(biāo)，然而對兩種免疫器官的酶活力的檢測卻并不常見。本文通過考察飼料中添加COS對仔豬胸腺、脾臟的相關(guān)免疫酶活力的影響，探究飼料中添加COS對仔豬免疫的影響，為COS作為飼料中添加的免疫增強劑的研究提供數(shù)據(jù)積累。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用COS系本試驗室自行制備（聚合度在2～8，脫乙酰度＞95%，平均分子量＜1 kDa）。免疫酶試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。RIPA蛋白裂解液購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織樣品的采集

本試驗在四川省遂寧市高金生態(tài)牧業(yè)豬場進(jìn)行。飼養(yǎng)試驗共計28 d。試驗分為兩組，每組10頭仔豬，其中一組為對照組，一組為試驗組（COS組）。仔豬斷奶后，對照組仔豬飼喂基礎(chǔ)仔豬日糧，試驗組仔豬飼喂含COS（50 g/t）的試驗日糧。仔豬飼喂28 d后，屠宰仔豬，取仔豬胸腺、脾臟的樣本，生理鹽水沖洗后置于滅菌的離心管中，快速存于液氮中。

1.2.2 免疫酶檢測

在空白對照組和COS組分別隨機抽取5個樣本，利用勻漿器和蛋白裂解液將其研磨成漿，低溫靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清待用。

一氧化氮合酶（NOS）總活力、NOS分型活力及過氧化氫酶（CAT）活力測定根據(jù)南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)

統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行方差分析，所有試驗數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，差異顯著時對平均值進(jìn)行Duncan's法多重比較?！?”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01。

2 試驗結(jié)果

2.1 COS對仔豬胸腺、脾臟NOS活力的影響

飼料中添加COS對仔豬胸腺、脾臟相關(guān)氧化酶活力的影響均通過對組織裂解液的檢測來評估。試驗結(jié)果如圖1，COS組的仔豬胸腺、脾臟的NOS活力較空白對照組分別提升了43.5%（P＜0.01）和5.3%。NOS可分為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（cNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）兩種。NOS分型檢測結(jié)果如圖2、圖3、圖4，仔豬胸腺cNOS活力顯著提升了74.9%（P＜0.01）（見圖4），其余樣本相關(guān)NOS活力變化并不明顯。

圖1 COS對仔豬胸腺（a）、脾臟（b）NOS活力的影響

圖2 COS對仔豬胸腺（a）、脾臟（b）總一氧化氮合酶（TNOS）活力的影響

圖3 COS對仔豬胸腺（a）、脾臟（b）iNOS活力的影響

圖4 COS對仔豬胸腺（a）、脾臟（b）cNOS活力的影響

2.2 COS對仔豬胸腺、脾臟CAT活力的影響

檢測飼料中添加COS對仔豬胸腺、脾臟CAT活力的影響試驗結(jié)果如圖5，COS組的仔豬胸腺的CAT活力較空白對照組提升了45.6%（P＜0.01），脾臟CAT活力比空白對照組提升了49.3%(見圖5)。因仔豬樣品個體差異較大，所有試驗結(jié)果方差較大，所以未標(biāo)記的均沒有顯著性差異。

3 小結(jié)與討論

圖5 COS對仔豬胸腺（a）、脾臟（b）CAT活力的影響

隨著對人體健康、環(huán)境保護(hù)概念的認(rèn)知程度日益增高，對畜牧業(yè)的要求也日漸升高。由于市場需求和經(jīng)濟效益，人們往往通過生長激素、抗生素等促進(jìn)家禽、家畜的生長和免疫力的增強，然而激素和抗生素的不當(dāng)使用對人們的健康和安全造成了很大的困擾[11]，因而天然產(chǎn)物飼料添加劑的開發(fā)日益受到關(guān)注[12]，日本早在20世紀(jì)就已經(jīng)開始將寡糖應(yīng)用在食品和飼料添加劑中。COS是由殼聚糖降解獲得的，由2～10個糖單位的糖苷鍵鏈接而成的寡聚物，在抗炎、抗腫瘤、促生長、增強免疫等方面均表現(xiàn)出良好的生物活性功能。本研究將COS添加到仔豬飼料中，檢測COS可能對仔豬免疫性能產(chǎn)生的影響，并嘗試推測其作用機制，以便為其在畜牧業(yè)的應(yīng)用研究提供一定的參考。

本文主要對飼料中添加COS對仔豬胸腺、脾臟免疫酶活力的影響進(jìn)行了檢測。NOS是催化L-精氨酸與O2生成NO的合成酶，研究表明NO的降低與衰老和眾多老年疾病有關(guān)。cNOS主要分布在內(nèi)皮組織和神經(jīng)系統(tǒng)，負(fù)責(zé)基礎(chǔ)NO的合成，調(diào)節(jié)各種生理功能。iNOS在受到脂多糖等刺激后會大量釋放非生理濃度的NO，產(chǎn)生一系列病理作用。從試驗結(jié)果來看，COS對仔豬胸腺NOS活力有顯著的提升作用。并且鑒于對胸腺NOS活力良好的作用效果，本文進(jìn)一步對樣本NOS分型活力進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胸腺cNOS活力得到大幅提升，于是本文認(rèn)為COS可能主要是通過提升cNOS活力來促進(jìn)總NOS活力的提升。羥自由基的化學(xué)性質(zhì)十分活躍，能攻擊細(xì)胞內(nèi)的有機酸產(chǎn)生有毒的過氧化物，侵害體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等引起一系列細(xì)胞破壞作用。而CAT可以分解這種羥自由基，保護(hù)機體穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。試驗結(jié)果顯示，COS組仔豬胸腺和脾臟的CAT活力均有一定程度的提升，其中胸腺的CAT活力提升程度極為顯著，由此可見，COS可以通過提升仔豬免疫器官內(nèi)CAT活力來提升其免疫能力。

綜上，將COS作為免疫增強劑添加到飼料中能夠?qū)ψ胸i的免疫性能產(chǎn)生一定范圍的影響，推測其作用途徑可能是通過提升仔豬的免疫器官的免疫酶活力來實現(xiàn)的。