青貯苜蓿中抑菌活性乳酸菌的篩選及鑒定

■李東霞 楊富裕 王雁萍 楊慧曉 郭琳娜 王 雨

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193；2.鄭州大學(xué)離子束生物工程省重點實驗室，河南鄭州 450052；3.北京助爾生物科學(xué)研究院，北京 100085）

苜蓿（Medicago sativa L.）產(chǎn)草量高，營養(yǎng)豐富，是許多國家主要的飼料作物。隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，苜蓿已成為不可替代的保障飼草[1]。國內(nèi)市場的優(yōu)質(zhì)苜蓿產(chǎn)品一直處于供不應(yīng)求的狀態(tài)，苜蓿進(jìn)口量逐年增加。自2012年中央推行“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動”以來，我國苜蓿種植面積迅速擴大，苜蓿產(chǎn)量也大幅度提高[2]。提高苜蓿貯存技術(shù)，改善苜蓿儲藏品質(zhì)，保障優(yōu)質(zhì)苜蓿產(chǎn)品飼喂家畜對我國畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義。

近年來，將青貯技術(shù)應(yīng)用于苜蓿貯存在世界各地得到普遍的應(yīng)用和推廣[3]。在青貯發(fā)酵過程中，乳酸菌發(fā)酵糖類產(chǎn)生有機酸及其它抑菌物質(zhì)，抑制不良菌群的繁殖，從而使飼草營養(yǎng)物質(zhì)得以保存[4-5]。為了提高青貯效果，各種乳酸菌添加劑被廣泛應(yīng)用在青貯飼料的制作中，但是不同來源的乳酸菌對苜蓿這種飼草的適應(yīng)性不同，進(jìn)而會影響苜蓿青貯的效果[6-8]?？紤]到苜蓿自然附著的乳酸菌含量很少[9]，但在青貯過程中，適應(yīng)其生存環(huán)境的乳酸菌會保留，與雜菌競爭養(yǎng)分進(jìn)而大量繁殖。因此本研究以苜蓿自然青貯過程中存在的乳酸菌為篩選來源，以期從中找出適合苜蓿材料特點，抑菌活性強的菌株，為進(jìn)一步研究開發(fā)針對苜蓿青貯的乳酸菌添加劑提供優(yōu)良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 青貯樣品

選取河南省鄭州市郊區(qū)兩種紫花苜蓿品種：標(biāo)桿，WL343。在初花期收割，室內(nèi)晾曬8 h后，用鍘刀鍘至段長2～3 cm，分別裝入10個聚乙烯袋，每袋100 g，用真空包裝機抽真空并封口。在青貯前及青貯第3、5、10、15、30、60 d時分別取樣進(jìn)行乳酸菌的分離。

1.1.2 指示菌

枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌，均為鄭州大學(xué)離子束實驗室保存。

1.1.3 試劑及培養(yǎng)基

蛋白酶K、API 50 CH試劑條、MRS培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 青貯樣品中乳酸菌的分離及抑菌活性乳酸菌的篩選

將10 g青貯樣品加入到90 ml無菌水中，梯度稀釋后涂布于MRS固體培養(yǎng)基，30℃厭氧培養(yǎng)48 h后從中挑取單菌落，劃線純化2次，經(jīng)革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，挑出革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株，通過牛津杯雙層平板法對從青貯材料中分離到的乳酸菌進(jìn)行抑菌試驗[10]。

1.2.2 乳酸菌菌株抗菌活性物質(zhì)初步分析

試驗檢測了高抗菌活性乳酸菌菌株發(fā)酵上清液對溫度、pH值、蛋白酶的敏感性[11]。并通過高效液相色譜法分析培養(yǎng)24 h后乳酸菌發(fā)酵液中的主要有機酸成分，每株菌分別設(shè)三個重復(fù)。

1.2.3 乳酸菌的鑒定

根據(jù)乳酸菌生理生化特性、API 50碳源發(fā)酵結(jié)果以及16S rDNA序列分析對菌株進(jìn)行鑒定[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿青貯樣品中乳酸菌的分離

本試驗通過半選擇性MRS培養(yǎng)基，從不同青貯時間的苜蓿樣品中分離得到104株革蘭氏陽性,過氧化氫酶陰性的乳酸菌菌株。

2.2 乳酸菌的篩選

104株乳酸菌菌株其中有81株對4種指示菌均有不同程度的抑制作用，從中挑選出2株抑菌效果較強的菌株，分別是在青貯前分離到的菌株ZZU a10和青貯60 d分離到的菌株ZZU a200。表1顯示這兩株菌對指示菌均有很好的抑制效果。

表1 乳酸菌的抑菌活性

2.3 乳酸菌菌株抗菌活性物質(zhì)的初步分析

乳酸菌發(fā)酵上清液在不同處理下對指示菌的抑菌活性如表2所示，不同溫度對兩株菌的作用不同，ZZU a10的抑菌活性隨著溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢，而ZZU a200的抑菌活性并沒有受到溫度升高的影響；兩株乳酸菌的抑菌物質(zhì)對溫度的敏感性差別說明其抑菌物質(zhì)不同。在對兩株菌的發(fā)酵上清液調(diào)至不同pH值處理后發(fā)現(xiàn)兩株菌在酸性環(huán)境中均有較強的抑菌活性，且隨著pH值的升高，抑菌活性呈下降趨勢；但ZZU a200相對于ZZU a10對pH值更加敏感，其在發(fā)酵液pH值調(diào)至6.0時對四種指示菌的抑制作用完全消失，而ZZU a10在pH值8.0時依然有明顯抑菌活性；pH值敏感性差異進(jìn)一步說明兩株菌的抑菌物質(zhì)不同，ZZU a10的抑菌物質(zhì)能夠耐受中性甚至弱堿性環(huán)境，而ZZU a200的抑菌活性只能在低pH值下發(fā)揮作用，推測ZZU a200的抑菌物質(zhì)主要是菌株代謝產(chǎn)生的有機酸。蛋白酶K處理結(jié)果顯示，其對ZZU a200的抑菌活性沒有影響，ZZU a10的抑制作用完全消失，說明ZZU a10發(fā)揮抑菌活性的物質(zhì)是對蛋白酶敏感的蛋白類物質(zhì)，推測是一種細(xì)菌素。

利用高效液相色譜法測定ZZU a10及ZZU a200發(fā)酵上清液中有機酸的含量，結(jié)果如表3所示，這兩株菌有機酸產(chǎn)物中均含有乳酸、乙酸成分，而且乳酸含量最多，其次是乙酸，ZZU a200的發(fā)酵液中還含有少量丙酸；兩株乳酸菌均沒有檢測到丁酸成分。ZZU a200的各種有機酸含量均顯著高于ZZU a10（P＜0.05）。

表2 乳酸菌的抑菌活性

表3 發(fā)酵液中有機酸的產(chǎn)量（mg/ml）

2.4 乳酸菌菌株鑒定

如表4所示，這兩株乳酸菌都是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性。ZZU a10為球菌，而ZZU a200為桿菌；兩株菌都能在3.0%(W/V)的NaCl濃度生長，ZZU a200甚至能夠耐受6.5%(W/V)的NaCl濃度。兩株菌均可以耐受10℃低溫，ZZU a200甚至可以耐受50℃的高溫。兩株菌可以耐受pH值4.0～9.0的范圍，ZZU a200在pH值3.0的酸性環(huán)境中依然可以良好生長。

表4 菌株形態(tài)及生理生化特性鑒定結(jié)果

由表5可知，菌株ZZU a10可以利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖等17種碳源，對山梨醇、攏牛兒糖有微弱利用；菌株ZZU a200能夠利用的碳源較多，共24種，對鼠李糖、攏牛兒糖也有微弱利用。

將兩株乳酸菌測得的16S rDNA序列遞交到Gen-Bank，使用程序Blast來找尋與其有最大同源性的序列，并與檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列信息通過CLUSTAL W軟件比對。采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹（neighborjoining method），如圖1及圖2所示，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis被用作外圍菌株。

結(jié)合生理生化試驗，碳源發(fā)酵結(jié)果及16S rDNA序列結(jié)果分析，ZZU a10被鑒定為Enterococcus mundtii；ZZU a200被鑒定為Lactobacillus plantarum。

3 討論

在飼料中添加具有抑菌作用的乳酸菌除了能夠抑制雜菌的繁殖，降低飼料營養(yǎng)損失外，被家畜采食后還有助于維持腸道內(nèi)菌群平衡。乳酸菌抑制雜菌的方式主要是其代謝產(chǎn)物中含有抑菌物質(zhì)，包括有機酸及蛋白類細(xì)菌素等[13]。

表5 碳源發(fā)酵試驗結(jié)果

圖1 ZZU a10的16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2 ZZU a200的16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

試驗結(jié)果顯示，ZZU a10的抑菌物質(zhì)主要為蛋白類物質(zhì)，且與前人報道的細(xì)菌素情況一致，推測是一類細(xì)菌素[14]。細(xì)菌素的抑菌效果受到許多因素的影響，如溫度、pH值等[11,15-16]。溫度過高會改變細(xì)菌素分子結(jié)構(gòu)，抑菌活性也會隨之降低，甚至喪失；研究表明，ZZU a10的抑菌物質(zhì)具有很好的熱穩(wěn)定性，在100℃處理30 min的條件下依然有抑菌效果。對pH值而言，細(xì)菌素發(fā)揮抑菌作用需要在適宜的pH值范圍內(nèi)，pH值過低或過高同樣會影響細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)，引起抑菌活性的降低或喪失[17]。常見的細(xì)菌素Nisin在低pH值下有很強的抑菌活性,但在pH值高于7.0時活性喪失[18]。本實驗篩選到的ZZU a10產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在pH值2.0～8.0范圍內(nèi)均有明顯的抑菌活性，說明其具有更廣的環(huán)境適應(yīng)性。

研究表明，菌株ZZU a200發(fā)揮抑菌作用的主要成分為有機酸；有報道指出乳酸菌代謝產(chǎn)物中的有機酸對索氏志賀菌、大腸桿菌、沙門氏菌、單增生李斯特菌均有明顯抑制作用[19-20]。與之相似，ZZU a200對枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌有較強的抑制作用。實驗經(jīng)過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，ZZU a200有機酸含量豐富。有機酸的抑菌機理主要包括兩種，第一是有機酸可以降低其它雜菌細(xì)胞間質(zhì)的pH值，破壞其滲透壓體系，使得細(xì)胞消耗更多的能量來維持平衡，進(jìn)而抑制雜菌的生長和繁殖；第二是酸性物質(zhì)破壞雜菌的細(xì)胞膜，進(jìn)入其細(xì)胞內(nèi)，抑制某些大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)或脂類的合成代謝，干擾雜菌體內(nèi)正常的生命活動，最終達(dá)到抑菌效果[21]。有研究表明，乳酸菌有機酸發(fā)揮抑菌作用具有較強的熱穩(wěn)定性，在100℃的處理后，依然保持處理前92%以上的抑菌效果[22-23]。本研究結(jié)果顯示，ZZU a200的發(fā)酵液在100℃處理30 min后能夠保持與處理前一樣的抑菌效果，說明該菌株能夠耐受高溫的環(huán)境發(fā)揮抑菌活性；且該菌株表現(xiàn)出良好的理化性質(zhì)，能夠耐受高溫（50℃）、高鹽（6.5%）濃度，可利用的碳源范圍廣泛，說明ZZU a200具有較強的生存適應(yīng)性。其在苜蓿青貯中的添加效果有待進(jìn)一步研究驗證。

4 結(jié)論

從苜蓿青貯過程中分離到104株乳酸菌并篩選到兩株具有高抗菌活性的菌株——ZZU a10及ZZU a200，ZZU a10被鑒定為Enterococcus mundtii，發(fā)揮抑菌活性的主要成分為蛋白類物質(zhì)，ZZU a200被鑒定為及Lactobacillus plantarum，發(fā)揮抑菌活性的主要成分為有機酸。兩株菌的抑菌物質(zhì)分別在pH值范圍、溫度范圍表現(xiàn)出廣泛的耐受性，菌株ZZU a200在不同的溫度、pH值、鹽濃度環(huán)境下還表現(xiàn)出較強的生存適應(yīng)性。以上結(jié)果表明，這兩株菌在苜蓿飼料青貯中具有潛在應(yīng)用價值。