四物湯干預(yù)減輕乙醇對(duì)小鼠肝臟的損傷作用

研究報(bào)告

四物湯干預(yù)減輕乙醇對(duì)小鼠肝臟的損傷作用

白云峰1，李曉娟2，李永綱1，王立福1，李蓓2，王睿林1，李瑞生2

(1. 解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病診療與研究中心，北京100039；

2. 解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京100039)

【摘要】目的通過(guò)四物湯對(duì)小鼠酒精性肝損傷的干預(yù)效果的研究，闡明其對(duì)乙醇損傷肝臟的影響，為四物湯臨床防治酒精性肝病提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法選擇60只C57小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和四物湯低、中、高劑量(0.91、1.82、3.64 g/kg/d)組，每組12只，用50%乙醇灌胃建立酒精性脂肪肝模型，同時(shí)用四物湯進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)6周后，對(duì)各組小鼠的體質(zhì)量、肝指數(shù)、血清生化指標(biāo)和肝臟病理學(xué)改變進(jìn)行綜合對(duì)比分析。結(jié)果四物湯各劑量組小鼠與模型組相比其體重增長(zhǎng)量均顯著增加(P<0.05)，肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)，血清ALT、AST和TG含量(P<0.05)均顯著降低。四物湯從低到高劑量組的肝臟外觀從粗糙逐漸變光滑，顏色逐漸加深。病理結(jié)果也顯示肝臟脂肪變隨著劑量從低到高呈遞減的程度，而高劑量組小鼠的脂肪變改善效果最顯著。結(jié)論四物湯對(duì)小鼠酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】四物湯；乙醇； 肝臟損傷

[基金項(xiàng)目]解放軍第302醫(yī)院院長(zhǎng)創(chuàng)新基金：YNKT2013026。

[作者簡(jiǎn)介]白云峰(1970-)，男，博士，E-mail： yunfengbai3@yahoo.com.cn；李曉娟(1980-)，女，碩士，E-mail： sxlily55@163.com。并列第一作者。

[通訊作者]李瑞生(1969-)，男，博士，副研究員，從事人類(lèi)疾病動(dòng)物模型研究，E-mail： lrsheng@sohu.com；王睿林(1979-)，男，博士，主治醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合治療研究，E-mail： wrl7905@163.com。

【中圖分類(lèi)號(hào)】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.003

Protective effect of Siwu decoction on alcoholic hepatic injury in mice

BAI Yun-feng1，LI Xiao-juan2，LI Yong-gang1，WANG Li-fu1，LI Bei2，WANG Rui-lin1，LI Rui-sheng2

(1. Liver Disease Center of Combined TCM and Western Medicine，

2. Research and Technology Service Center, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039，China)

Abstract【】ObjectiveTo provide experimental data for clinical prevention and treatment of alcoholic liver disease in mice by a Chinese medicine, Siwu decoction, and study the intervention effect of Siwu decoction on alcoholic liver injury. MethodsSixty C57 mice were selected and randomly divided into the control group，model group and Siwu decoction low, medium and high dose (0.91, 1.82, 3.64 g/kg/d) groups, 12 mice in each group. The mouse models of alcoholic fatty liver were generated with gastric gavage of 50% ethanol, and Siwu decoction intervention was applied to these mouse models. Six weeks later，the mice body weight，liver index，serum biochemical indexes and liver pathological changes were determined and analyzed. ResultsCompared with the model group, Body weight gains of mice in all dose Siwu Decoction groups were significantly increased (P<0.05)，and liver indexes significantly decreased (P<0.05). The serum levels of ALT, AST and TG content significantly decreased(P< 0.05)．The liver gross appearance was gradually changed from rough to smooth and the color gradually deepened in the mice of Siwu decoction groups, increasingly from low to high dose group．Pathological examination showed a decrease of hepatic steatosis in the mice treated with Siwu decoction from low dose to high dose, and mice in the high dose group showed the best improvement of hepatic steatosis. Conclusion The Chinese medicine Siwu decoction has a protective effect on alcoholic liver injury in mice.

【Key words】Siwu decoction; Ethanol; Liver damage

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于長(zhǎng)期大量飲酒所導(dǎo)致的肝臟疾病，由于嗜酒已成為當(dāng)今世界日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，因此酒精性肝病的研究也成為全球的研究熱點(diǎn)[1]。乙醇進(jìn)入體內(nèi)會(huì)經(jīng)過(guò)多種途徑對(duì)肝臟造成損傷[2]，其中由乙醇引起氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的自由基可使線粒體膜通透性增加[3]，引起細(xì)胞能量代謝障礙而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。而中藥四物湯由白芍、當(dāng)歸、川芎和地黃組成，這四種中藥均歸經(jīng)入肝，具有補(bǔ)血養(yǎng)肝，行瘀破滯之功[4]，近年來(lái)還報(bào)道四物湯具有增強(qiáng)血清超氧化物歧化酶活力，促進(jìn)自由基消除的作用[5]。因此為了探討四物湯是否對(duì)小鼠酒精性肝損傷過(guò)程具有干預(yù)作用，本實(shí)驗(yàn)選取近交系C57小鼠[6]，通過(guò)觀察四物湯對(duì)急性酒精性肝損傷試驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量、肝指數(shù)和肝細(xì)胞脂肪變性等的影響，分析其對(duì)急性酒精性肝損傷的防護(hù)作用及作用機(jī)理，以期為探尋ALD臨床治療藥物奠定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF級(jí)C57雄性小鼠60只，單鼠體質(zhì)量為20 g～22 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證【SCXK(軍)2012-0004】，實(shí)驗(yàn)在本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)中進(jìn)行，使用許可證【SYXK(軍)2012-0010】。

1.2試劑及飼料

四物湯顆粒由302醫(yī)院藥劑室制備(3 g/袋)；乙醇(分析純，純度>99.7%)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130315)；生理鹽水(解放軍第302醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：130527405，石家莊四藥有限公司)。

1.3動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方法

健康雄性C57小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為5個(gè)組，分別為正常對(duì)照組、模型組、四物湯顆粒高劑量組(3.64 g/kg)、中劑量組(1.82 g/kg)、低劑量組(0.91 g/kg)，每組各12只。四物湯的劑量根據(jù)人臨床劑量換算，換算公式：小鼠劑量(g/kg)=9.1 × 人臨床劑量(0.1 g/kg)。此劑量作為低劑量，中劑量與高劑量分別為低劑量的2倍和4倍。每日正常組和模型組灌胃生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組灌胃不同劑量的四物湯，灌完間隔30 min后[7]，正常組繼續(xù)用生理鹽水灌胃，其余各組小鼠每日給予濃度50%乙醇灌胃，灌胃量為12 mL/(kg體重)[8]，持續(xù)6周。小鼠每周稱(chēng)重1次，按體重調(diào)整四物湯、乙醇灌胃量。實(shí)驗(yàn)期間小鼠均可自由進(jìn)食和飲水。

1.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天觀察各組小鼠精神狀態(tài)，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d禁食12 h，次日稱(chēng)重后經(jīng)小鼠眶后靜脈叢采血，離心取血清，檢測(cè)各組小鼠血清生化指標(biāo)：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)。取血后迅速取各組小鼠肝臟組織，稱(chēng)取肝臟重量，按公式計(jì)算：肝指數(shù)=肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g) × 100%；然后采集所有小鼠相同部位的肝組織用甲醛固定進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察分析各組小鼠肝臟的組織病理學(xué)結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組間采用方差分析進(jìn)行比較，以P<0.05顯示差異是否有顯著性。

2結(jié)果

2.1各組小鼠體重增長(zhǎng)量及生化指標(biāo)的分析

通過(guò)對(duì)各組小鼠體重增長(zhǎng)量、肝指數(shù)和生化指標(biāo)的對(duì)比分析顯示：與對(duì)照組比較，模型組小鼠的體重增長(zhǎng)量顯著降低(P<0.05)，肝指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，四物湯各劑量組小鼠的體重增長(zhǎng)量均顯著增加(P<0.05)，肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST和TG顯著增高(P<0.05)；而與模型組比較，四物湯各劑量組血清ALT、AST和TG含量明顯降低(P<0.05)，其中四物湯對(duì)AST和TG含量的影響呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性(表1)。

表1　各組小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)和生化指標(biāo)分析

注：與對(duì)照組比較 *P<0.05，與模型組比較△P<0.05。

Note.*P<0.05, compared with the control group；△P<0.05, compared with the model group.

2.2各組小鼠肝臟外觀的分析

肝臟外觀標(biāo)本顯示：對(duì)照組小鼠肝臟被膜光滑，呈紅褐色，質(zhì)地柔軟；模型組小鼠肝臟邊緣呈圓鈍狀，色澤呈淡紅色，質(zhì)地較粗糙。四物湯各劑量組肝臟外觀均較模型組肝臟顏色呈暗紅色，而且從低劑量組至高劑量組肝臟顏色逐漸加深，肝臟外觀從粗糙逐漸變光滑，其結(jié)果見(jiàn)圖1(圖1見(jiàn)文后彩插2)。

2.3各組小鼠肝組織病理學(xué)的分析

肝臟病理學(xué)研究結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列規(guī)則且以中心靜脈放射排列，匯管區(qū)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠肝細(xì)胞明顯腫脹，肝小葉界限模糊，肝細(xì)胞內(nèi)有成堆的脂肪滴，已呈現(xiàn)典型的酒精性脂肪肝病變。與模型組比較，四物湯低劑量組和中劑量組的脂肪變程度均有所改善，而高劑量組小鼠肝細(xì)胞腫脹減輕，少數(shù)肝細(xì)胞輕度水腫，肝小葉及匯管區(qū)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，脂肪變程度明顯減輕(圖2，圖2見(jiàn)文后彩插2)。

3討論

酒精過(guò)量引起的肝損傷已經(jīng)成為嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。酒精性肝病的發(fā)生與乙醇及其代謝產(chǎn)物的直接毒性、營(yíng)養(yǎng)改變、脂質(zhì)過(guò)氧化及遺傳免疫因素等有關(guān)[9]，目前臨床上仍以戒酒為主要的治療手段，至今仍未找到有效的治療靶點(diǎn)和方法，故尋找有效預(yù)防及延緩酒精性肝病發(fā)展的理想藥物尤為重要[10]。近年來(lái)各類(lèi)中藥材以及從各類(lèi)藥學(xué)植物中提取的有效成分應(yīng)用于酒精性肝病治療逐漸成為研究熱點(diǎn)。于海玲等[11]證實(shí)了由人參、川芎、白芍、胡桃仁及鴨肉等制備而成的肝康顆粒通過(guò)減輕酒精對(duì)肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，從而抑制酒精的肝毒性反應(yīng)；付斌等[12]也證實(shí)了由靈芝、葛根、枳椇子、枸杞子為原料的護(hù)肝片能夠減輕酒精對(duì)肝細(xì)胞的損傷；劉超群等[13]將大蒜中提取的大蒜多糖應(yīng)用于酒精性肝損傷的治療也得到了有效的結(jié)果。眾所周知，四物湯是中醫(yī)臨床具有活血化瘀作用的基礎(chǔ)方，常用于治療可見(jiàn)血瘀證候的多種疾病。最新研究表明其具有消除自由基的作用[5]，而自由基在酒精性肝損傷的發(fā)病過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用。但至今尚未見(jiàn)四物湯應(yīng)用于酒精性脂肪肝治療的報(bào)道。臨床觀察發(fā)現(xiàn)酒精性脂肪肝中醫(yī)證候類(lèi)型之“血瘀證”是其主要的證型，治療可以四物湯為基礎(chǔ)方以活血化瘀。

因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用四物湯對(duì)酒精中毒小鼠干預(yù)6周后，對(duì)各組小鼠體重增長(zhǎng)量和肝指數(shù)結(jié)果分析顯示：模型組小鼠體重增長(zhǎng)量顯著降低(P<0.05)，肝指數(shù)顯著增加(P<0.05)，表明長(zhǎng)期飲酒會(huì)降低小鼠食欲和對(duì)食物的吸收能力，同時(shí)肝臟組織存在受損腫脹情況。而四物湯各組結(jié)果與模型組相比較，小鼠體重增長(zhǎng)量顯著增加(P<0.05)，肝指數(shù)顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明四物湯具有改善酒精中毒小鼠的食欲和吸收功能的作用，對(duì)肝臟腫脹情況有所改善。血清ALT和AST活性升高為肝細(xì)胞損傷的特異性指標(biāo)，只要有1%的肝細(xì)胞壞死，便可使血中酶活性增高1倍。而肝臟病理學(xué)檢查則被認(rèn)為是判斷肝臟損傷的金標(biāo)準(zhǔn)[14]。模型組小鼠血清中ALT、AST和TG與對(duì)照組比較均顯著增高(P<0.05)；而四物湯各劑量組血清ALT、AST和TG含量與模型組比較均顯著降低(P<0.05)，提示四物湯具有較強(qiáng)的抗酒精性肝臟損傷的效應(yīng)。肝臟外觀和肝臟病理學(xué)結(jié)果顯示：四物湯從低劑量到高劑量對(duì)酒精性肝損傷有遞增的改善作用，也說(shuō)明四物湯對(duì)酒精性肝損傷出現(xiàn)的脂肪變性和炎癥病理學(xué)改變具有抑制和減緩發(fā)展的作用。因此初步推斷四物湯可能是通過(guò)改善微循環(huán)消除自由基而發(fā)揮抗酒精性肝損傷的效應(yīng)，而作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

總之，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用四物湯干預(yù)小鼠酒精性肝損傷，表明四物湯具有抑制和減緩肝細(xì)胞脂肪變性、減輕炎癥和修復(fù)肝臟細(xì)胞的作用，對(duì)乙醇誘導(dǎo)的小鼠酒精性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，為ALD發(fā)病機(jī)制和臨床治療藥物的研發(fā)開(kāi)辟了新的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Gao B, Bataller R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets [J]. Gastroenterology, 2011, 141(5):1572-1585．

[2]Jampana S, Rashid K. Pathogenesis of alcoholic hepatitis: role of inflammatory signaling and oxidative stress [J]．World J Hepatol, 2011, 3(5): 114-117.

[3]Yan M, Zhu P, Liu HM, et al. Ethanol induced mitochondria injury and permeability transition pore opening: role of mitochondria in alcoholic liver disease [J]．World J Gastroenterol, 2007, 13: 2352-2356．

[4]張榮桃. 四物湯的現(xiàn)代研究進(jìn)展 [J]. 北京中醫(yī)藥, 2012, 31(1): 73-75．

[5]王茜. 四物湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 [J]. 黑龍江中醫(yī)藥, 2012, 4:48-49．

[6]白云峰, 李曉娟, 李永綱, 等. 近交系小鼠酒精性脂肪肝模型建立的分析 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24(1): 8-11.

[7]付萍, 楊銘, 陳穎麗, 等. 玉米肽對(duì)小鼠酒精性肝損傷保護(hù)作用的研究 [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技, 2008, 15(2): 115-116．

[8]吳偉青, 陳靜, 劉超群, 等. 綠茶多酚對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用 [J]. 食品科學(xué), 2011, 32(13): 310-313．

[9]李曉娟, 張大鹍, 隋麗華, 等. 超聲在評(píng)價(jià)大鼠酒精性脂肪肝模型中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 23(4): 19-22．

[10]郝銀菊, 趙瑩, 吳洋, 等. 氧化槐定堿對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用 [J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2012, 33(21): 3215-3217．

[11]于海玲, 郭建鵬, 李迎軍, 等. 肝康顆粒對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用 [J]. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 33(1): 13-15.

[12]付斌, 楊靜, 胡居吾, 等. 一種解酒護(hù)肝片對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用的研究 [J]. 江西化工, 2012, 2: 83-86.

[13]劉超群, 陳靜, 黃雪松, 等. 大蒜多糖對(duì)慢性酒精中毒小鼠肝損傷的保護(hù)作用 [J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2012, 38(1): 23-27.

[14]向志鋼, 李先輝, 劉鋒, 等. 果王素對(duì)小鼠酒精性肝病保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 20(3): 373-376.

〔修回日期〕2014-10-20

簡(jiǎn)報(bào)