單側(cè)腎切除及微滲透泵灌注血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)小鼠腎纖維化與高血壓模型的建立

研究報告

單側(cè)腎切除及微滲透泵灌注血管緊張素II誘導(dǎo)小鼠腎纖維化與高血壓模型的建立

陳建，曾莉， 陳剛，何立群

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海200021)

【摘要】目的建立單側(cè)腎切除及微滲透泵灌注血管緊張素II誘導(dǎo)小鼠腎纖維化模型。方法將36只雄性野生型 c57BL/6小鼠隨機分為3組正常組、模型組、生理鹽水對照組，每組12只。正常組不做處理，模型組行單側(cè)腎切除及微滲透泵灌注血管緊張素II，生理鹽水對照組行單側(cè)腎切除及微滲泵灌注生理鹽水。觀察造模前及造模后第2周、第4周小鼠血壓，及造模4周后的24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、腎臟病理。結(jié)果實驗第二周時，生理鹽水對照組(P<0.05)及模型組(P<0.01)的血壓較正常組升高，模型組較生理鹽水對照組也升高(P<0.05)；實驗第四周時，模型組血壓較正常組(P<0.01)及生理鹽水對照組(P<0.05)均升高。模型組的血肌酐、血尿素氮數(shù)值較正常組均上升(P<0.05)；模型組24 h尿蛋白定量數(shù)值較正常組與生理鹽水對照組的升高(P<0.01)，模型組HE染色結(jié)果近曲小管上皮細胞渾濁腫脹；模型組Masson染色結(jié)果膠原纖維陽性率顯著高于正常組和生理鹽水對照組(P<0.05)。結(jié)論 單側(cè)腎切除+微滲透泵灌注血管緊張素II可以成功建立小鼠腎纖維化模型及高血壓模型。

【關(guān)鍵詞】血管緊張素II；高血壓；腎纖維化；高血壓腎損害；

[基金項目]國家自然科學(xué)基金(81173219)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計劃項目(編號:11ZR1437700)；國家臨床重點?？?，國家中醫(yī)藥管理局重點學(xué)科；上海市中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃項目(ZYSNXD-CC-YJXYY)。

[作者簡介]陳建(1987-)，男，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療慢性腎臟病的臨床與基礎(chǔ)研究。E-mail: 13120557664@163.com。

[通訊作者]陳剛(1973-)，男，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合診治腎病的臨床和實驗研究。Email: 53821650@163.com。

【中圖分類號】R33【文獻標(biāo)識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.007

Establishment of a mouse model of renal fibrosis and

hypertension induced by unilateral nephrectomy and

infusion of angiotensin II using a micro-osmotic pump

CHEN Jian, ZENG Li, CHEN Gang, HE Li-qun

( Shuguang Hospital，Shanghai University of TCM，Shanghai 200021, China)

Abstract【】ObjectiveTo establish a mouse model of renal fibrosis and hypertension induced by unilateral nephrectomy and infusion of angiotensin II using a micro-osmotic pump. Methods Thirty-six 8-week old wild type male c57BL/6 mice were randomly divided equally into three groups. The normal group was not treated, model group underwent unilateral nephrectomy and infusion of angiotensin II using a micro-osmotic pump, and the saline control group underwent unilateral nephrectomy and infusion of physiological saline using a micro-osmotic pump. Blood pressure was measured before and two and four weeks after modeling. The 24 h urine protein quantity, serum creatinine (Scr), and blood urea nitrogen (BUN) were measured, and renal pathology was examined at 4 weeks after modeling. ResultsAt 2 weeks of the experiment, the blood pressure in the saline control group and model group was significantly higher compared with that of the normal group (P<0.05, P<0.01), and the blood pressure of the model group was significantly higher than that of the saline control group (P<0.05). Four weeks after operation, the blood pressure in the model group was still higher than that of the normal group (P<0.01) and the saline control group (P<0.05). Both the levels of Scr and BUN in the saline control group and model group were significantly higher than those of the control group (P<0.05, P<0.05). The 24 h urine protein quantity in the model group was markedly higher compared with that of the saline control group and normal group (P<0.01). The pathological examination showed that proximal tubular epithelial cells were swollen in the model group. Histology using Masson staining showed that the positive rate of collagen fibers in the model group was significantly higher than that of the normal group and saline control group (P<0.05).ConclusionsOur results demonstrate that a mouse model of renal fibrosis and hypertension can be successfully established by unilateral nephrectomy and infusion of angiotensin II using a micro-osmotic pump.

【Key words】Angiotensin II; Hypertension; Renal fibrosis; Hypertension; Renal damage; Mouse

腎臟是高血壓病最重要、最常見的靶器官之一。長期的高血壓可導(dǎo)致高血壓性腎損害，特別是惡性高血壓，如不干預(yù)最終將發(fā)展至腎功能衰竭。據(jù)文獻報道，國內(nèi)外由高血壓造成的腎臟損害進入慢性腎功能不全的患者人數(shù)，呈逐年上升趨勢[1，2]。腎纖維化是高血壓產(chǎn)生腎臟損害的表現(xiàn)形式，也是慢性腎臟病發(fā)展為終末期腎衰竭的共同通路。目前常用的腎纖維化模型雖然纖維化程度等都符合實驗需求，但其與人類高血壓導(dǎo)致的腎纖維化發(fā)生機理相差很大，實驗中常用的高血壓模型也不一定能導(dǎo)致腎損害，所以目前仍沒有一種合適的因高血壓病導(dǎo)致腎纖維化的理想模型，我們嘗試建立更接近人類高血壓腎損害發(fā)病機理的動物模型——微滲泵灌注血管緊張素II誘導(dǎo)腎纖維化小鼠動物模型。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物：選用鼠齡8周的雄性野生型 c57BL/6小鼠36只，體重(25±3)g, 由上海斯萊克實驗有限公司提供，SCXK( 滬)2012-0002。實驗小鼠分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SYXK( 滬)2009-0069，溫度25℃、12 h 光照、45% 濕度的環(huán)境中，自由飲水，進食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料，封閉管理。

1.1.2實驗材料及藥物： 人血管緊張素 II (AngII)醋酸鹽：Sigma公司生產(chǎn)；ALZET微滲透泵：Sigma公司生產(chǎn)。

1.1.3主要試劑： 尿蛋白定量試劑盒、尿素氮試劑盒、肌酐試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)。

1. 1.4主要儀器： 小鼠血壓測定使用美國 Visitech Systems BP-2000 小鼠無創(chuàng)血壓儀。M5 型酶標(biāo)儀(美國MD公司)，GL-20G-II型高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。Microm HM 325 輪轉(zhuǎn)切片機( 美國MD公司)，Leica DMIL 倒置相差顯微鏡(美國萊卡公司)。

1.2實驗方法

1.2.1分組：將36只雄性野生型 c57BL/6小鼠隨機分為3組正常組、模型組、生理鹽水對照組，每組12只。

1.2.2模型制作： 模型組：先以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，將手術(shù)臺上放置成人尿墊，防止手術(shù)低體溫現(xiàn)象，使小鼠向右側(cè)臥，暴露背部左腎區(qū)，剃去左腎區(qū)毛發(fā)備皮，以安爾碘消毒，70%酒精脫碘，從距左脊肋骨0.5 cm處作斜向外方切口。經(jīng)后腹膜取腎臟，暴露腎臟，結(jié)扎后切除整個左腎，縫合。放置于干燥新鼠籠內(nèi)，待其蘇醒后能自行飲食飲水，為第一步切腎手術(shù)成功，術(shù)后如前飼養(yǎng)一周。1周后行Alzet微滲透泵置入手術(shù)，先以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，使小鼠俯臥，暴露后頸部，剃去后頸部毛發(fā)備皮，以安爾碘消毒，70%酒精脫碘，在后頸部作一個1.5 cm橫切口，以血管鉗分離皮下組織至右腰部，植入內(nèi)置Ang II的Alzet微滲透泵縫合，在放置ALZET微滲透泵過程中，應(yīng)將開口朝內(nèi)防止?jié)B出藥物污染傷口，影響實驗及傷口愈合。生理鹽水對照組：造模方法同上。正常組不做處理。模型組中Alzet微滲透泵灌注Ang II，生理鹽水對照組中Alzet微滲透泵灌注生理鹽水。

1.2.3標(biāo)本采集及標(biāo)本制作：

1.2.3.1尿液: 在造模4周后處死前1 d用代謝籠收集實驗各組小鼠的尿液測24 h尿蛋白定量。

1.2.3.2血液: 各組實驗小鼠，造模4周后處死，眶靜脈采血待測。

1.2.3.3腎臟組織：右腎組織用4%中性甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、包埋，切成2 μm厚石蠟片作HE、Masson染色。

表1　各組小鼠0、2、4周收縮壓的結(jié)果

與同期正常組比較,*P<0.05，**P<0.01， 與同期模型組比較,△P<0.05，△△P<0.01.

Note.Compared with the normal group in the same periods,*P<0.05,**P<0.01.Compared with the model group in the same periods,△P<0.05,△△P<0.01.

表2　實驗結(jié)束時各組小鼠血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量的結(jié)果 ±s)

與同期正常組比較, *P<0.05, **P<0.01。與模型組比較△△P<0.01。

Note.Compared with the normal group in the same periods. *P<0.05，**P<0.01.Compared with the model group in the same periods,△△P<0.01.

1.2.4觀察指標(biāo)及方法：

造模前及造模后第2、4周無創(chuàng)血壓儀測小鼠血壓(每次每只小鼠測量10次取平均值)。造模后4周后處死全部小鼠，眶靜脈采血測Scr、BUN， 24 h尿蛋白定量檢測。用光鏡觀察HE、Masson染色腎組織病理變化。

1.2.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析：計數(shù)資料用X2檢驗，計量資料用t檢驗，組間比較用方差分析。分析所得數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分別進行統(tǒng)計分析，P≤0.05將被視為所檢驗的數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)意義,P≤0.01將被視為有高度顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1造模前及造模后2、4周收縮壓的比較

結(jié)果：造模后2周時，生理鹽水對照組(P<0.05)及模型組(P<0.01)的血壓較正常組升高，模型組較生理鹽水對照組也升高(P<0.05)；造模后4周時，模型組血壓較正常組(P<0.01)及生理鹽水對照組(P<0.05)均升高(表1)。

2.2造模4周后各組小鼠血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量的比較。

實驗結(jié)束時，生理鹽水對照組及模型組的血肌酐數(shù)值較正常組均上升(P<0.05)；模型組的血尿素氮數(shù)值較正常組升高(P<0.05)，而與生理鹽水對照組比較無明顯差異；模型組較正常組與生理鹽水對照組的24 h尿蛋白定量數(shù)值升高(P<0.01)(表2)。

2.3小鼠腎組織HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果：正常組腎小球及腎小管未見明顯異常。生理鹽水對照組及模型組出現(xiàn)近曲小管上皮細胞渾濁腫脹，模型組較多；生理鹽水對照組及模型組腎小球均未見明顯異常(圖1，見文后彩插6)。

2.4小鼠腎組織Masson染色

Masson染色結(jié)果：正常組和假手術(shù)組僅在血管和基底膜處有綠染的膠原纖維，間質(zhì)成分比較少。模型組膠原成分增多，大量的間質(zhì)細胞浸潤，綠染的膠原纖維明顯增多(圖2，見文后彩插6)。

Masson染色膠原陽性率結(jié)果比較：模型組Masson結(jié)果膠原纖維陽性率顯著高于正常組和生理鹽水對照組(P<0.05)(圖3)。

圖3　各組小鼠膠原纖維陽性率比較。 Fig.3　Comparison of the positive rates of collagen fibers in the mice of each group

3討論

目前腎纖維化模型較多，以往對腎纖維化的研究多通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型和慢性腎衰竭大、小鼠動物模型進行，更符合梗阻性腎損害患者。經(jīng)典的腎衰竭模型有陽離子化牛血清白蛋白制作的慢性腎衰動物模型、腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎衰動物模型、腎大部切除慢性腎衰動物模型。其模型的發(fā)病機理與高血壓導(dǎo)致的腎纖維化相去甚遠。目前常用的高血壓模型有自發(fā)型高血壓模型[3,4]，但是其不一定能發(fā)生腎損傷。腎動脈結(jié)扎法制作的高血壓模型[5-7]，方法有兩腎一夾型腎血管性高血壓大鼠模型、單腎單夾型腎血管性高血壓大鼠模型、雙腎雙夾型腎血管性高血壓大鼠模型，此種高血壓模型屬于繼發(fā)性高血壓，所以不能歸結(jié)為原發(fā)性高血壓。其他還有高糖高脂飲食誘導(dǎo)高代謝型高血壓模型等[8]，也不能成功誘發(fā)高血壓腎損害而產(chǎn)生腎纖維化。高血壓腎損害通常是指原發(fā)性的高血壓所致的腎臟小動脈硬化或腎實質(zhì)損害[9]。腎素血管緊張素系統(tǒng)是原發(fā)性高血壓主要的機制之一，血管緊張素II又是腎素血管緊張素系統(tǒng)中，最重要的縮血管物質(zhì)，在高血壓發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。國內(nèi)外許多學(xué)者應(yīng)用外源性灌注血管緊張素II誘導(dǎo)大小鼠制作高血壓模型[10，11]，因這類模型為血管緊張素II引起的高血壓，可以將其歸于原發(fā)性高血壓范疇。

Ang II具有很高的生物活性，是血管緊張素系統(tǒng)中最主要的效應(yīng)物質(zhì)，可以升高全身血壓及腎小球毛細血管內(nèi)壓直接參與進行性腎臟損害，導(dǎo)致腎臟小動脈硬化或腎實質(zhì)損害，可引起腎臟血管收縮造成腎血流量的下降和腎臟血管阻力的增加，腎小球內(nèi)壓力也隨之升高，系膜細胞收縮，導(dǎo)致對蛋白的選擇性通透性增加、并能激活與纖維化相關(guān)的生長因子，通過調(diào)節(jié)炎癥和纖維化的過程，參與腎臟疾病的發(fā)病機制[12]。

高血壓腎損害的臨床表現(xiàn)為持續(xù)性的高血壓，并伴有持續(xù)性微量白蛋白尿或輕中度蛋白尿，或出現(xiàn)腎功能損害(如肌酐、尿素氮升高)等臨床表現(xiàn)。本研究在造模前及造模后2周、4周時模型組血壓較正常組與對照組都升高，說明模型組已經(jīng)出現(xiàn)血壓升高現(xiàn)象(表1)。當(dāng)實驗結(jié)束時，模型組的血肌酐、血尿素氮數(shù)值較正常組均上升(P<0.05)；模型組24 h尿蛋白定量數(shù)值較正常組與生理鹽水對照組的升高(P<0.01)(表2)。本研究中模型組血壓升高后已經(jīng)出現(xiàn)蛋白尿及肌酐、尿素氮的升高，則說明該模型已經(jīng)出現(xiàn)高血壓腎損害癥狀。高血壓腎損害的早期病理表現(xiàn)通常為良性腎硬化，腎小球及腎間質(zhì)小管出現(xiàn)缺血性損害，如腎小管間質(zhì)細胞缺血腫脹等，高血壓早期大多數(shù)腎小球形態(tài)正常，僅有少量腎小管萎縮，間質(zhì)纖維化，晚期可見到腎小球硬化和嚴重的間質(zhì)小管損傷，即腎小管多灶狀和片狀萎縮部分代償肥大，大量腎間質(zhì)纖維化[9]。本研究模型組HE病理表現(xiàn)為近曲小管上皮細胞渾濁腫脹，正是近曲小管缺血的表現(xiàn)，證明該模型已經(jīng)出現(xiàn)了高血壓腎損害的病理表現(xiàn)，生理鹽水組因體內(nèi)鹽分較多，所以也會出現(xiàn)輕微的損害近曲小管上皮細胞。膠原纖維在正常腎組織的表達很少，而在腎間質(zhì)纖維化時則表達較多，本研究中模型組Masson染色病理表現(xiàn)為大量的間質(zhì)細胞浸潤及綠染的膠原纖維明顯增多。膠原是反應(yīng)腎纖維化的主要指標(biāo)，Masson染色證明模型組已經(jīng)出現(xiàn)腎臟纖維化。

目前大部分高血壓模型及腎纖維化模型，都不滿足高血壓腎損害至腎纖維化。而本研究通過外源性灌注Ang II，使小鼠血壓升高，并且切除小鼠一側(cè)腎臟后，另一側(cè)成為孤立腎，是高血壓完全作用與孤立腎上，加重腎臟損害，進而縮短實驗周期，同時使纖維化程度加重，并且所觀察到的腎臟無機械性損傷。當(dāng)造模4周后，模型已經(jīng)出現(xiàn)了蛋白尿及肌酐、尿素氮的升高現(xiàn)象，證明該模型已經(jīng)出現(xiàn)高血壓腎損害現(xiàn)象。本研究中HE染色證明模型已經(jīng)出現(xiàn)近曲小管上皮細胞渾濁腫脹現(xiàn)象，證明該模型以出現(xiàn)腎損傷現(xiàn)象。Masson證明纖維化已經(jīng)形成，證明該模型為高血壓腎損害至腎纖維化模型。如想制作纖維化程度較重的模型，則可以增加Ang II灌注時間。因此，單側(cè)腎切除+微滲透泵灌注血管緊張素II可以成功建立小鼠腎纖維化模型及高血壓模型，是較為理想高血壓腎損害致腎纖維化模型。

參考文獻：

[1]Ruliope LM. The kidney as a sensor of cardiovascular risk in essential hypertension [J]. J Am Soc Nephrol, 2002, 13:165-168．

[2]周福德, 王梅. 北京市血液透析的發(fā)展與質(zhì)量改進 [J]. 中國血液凈化雜志, 2006, 5(3): 117-118．

[3]余國龍, 胡柯, 歐雅麗, 等. 自發(fā)性高血壓大鼠缺血再灌注性腦損傷實驗動物模型制備[J]. 中華高血壓雜志, 2009,

17(7): 633-635.

[4]袁麗粉, 杜勤, 陸平, 等. 高血壓合并動脈粥樣硬化大鼠模型的建立 [J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 27(23): 4197-4199.

[5]秦秋華, 蔣偉哲, 施曉霞, 等. 腎性高血壓大鼠模型制備方法的改進 [J]. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2011, 28(5): 671-673.

[6]王文靖, 潘毅, 楊濤. 兩腎一夾型高血壓大鼠模型的改良及評價 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2012, 18(1): 203-205

[7]楊小慢, 陸德琴, 李賢玉. 雙腎雙夾大鼠腎血管性高血壓模型的制作 [J]. 心腦血管病防治, 2009, 9(5): 341-343.

[8]劉曉宇, 姚茹, 吳大方. 長期高脂、高糖、高鹽飲食對大鼠熱和機械痛閾的影響 [J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2012, 17(4): 412-416.

[9]王海燕, 腎臟病學(xué) [M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2008: 1665.

[10]孫旭, 邊云飛, 劉改珍, 等. P-選擇素對血管緊張素II誘導(dǎo)的高血壓致血管重構(gòu)的影響 [J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2013, 11(4): 452-454．

[11]梁偉, 丁國華, 賈俊亞, 等. 血管緊張素II灌注大鼠模型腎小球足細胞損傷觀察 [J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志, 2006(5): 497-500.

[12]Wolf G, Ritz E.Combination therapy with ACE inhibitors and angiotensin II receptor blockers to halt progression of chronic renal disease: pathophysiology and indications [J]. Kidney Int, 2005, 67: 799-812.

〔修回日期〕2014-12-15