一株益生乳酸芽孢桿菌BLZ01的鑒定及其對肉雞腸道菌群的影響

張冬梅潘康成，2?倪學勤，2景 波劉明剛（．四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物微生態(tài)工程研究中心，成都630；2．動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都630）

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一株益生乳酸芽孢桿菌BLZ01的鑒定及其對肉雞腸道菌群的影響

張冬梅1潘康成1，2?倪學勤1，2景 波1劉明剛1
（1．四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物微生態(tài)工程研究中心，成都611130；2．動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都611130）

摘 要：本試驗旨在對一株產(chǎn)乳酸芽孢桿菌進行菌種的鑒定，并研究其對肉雞腸道菌群的影響。采用傳統(tǒng)的形態(tài)學、生理生化反應與16S rRNA序列分析相結(jié)合的方法對菌株BLZ01進行鑒定。選取20羽7日齡肉雞，隨機分成2組（每組10羽），對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組飼喂添加0．05 g／kg菌株BLZ01的試驗飼糧。飼喂至42日齡時，采用聚合酶鏈式反應－變性梯度電泳技術(shù)（PCR?DGGE）技術(shù)分析肉雞回腸、盲腸腸道菌群的多樣性。結(jié)果表明：1）菌株BLZ01確定為產(chǎn)L－乳酸的巨大芽孢桿菌；2）肉雞飼喂菌株BLZ01后，回腸、盲腸的條帶數(shù)均增多，濃度發(fā)生了明顯的變化；3）回收的條帶以未培養(yǎng)的細菌為主，已培養(yǎng)出的細菌是以乳桿菌屬為主。結(jié)果表明，芽孢桿菌BLZ01為一株產(chǎn)L－乳酸的巨大芽孢桿菌；肉雞飼喂該菌后可以提高其腸道菌群的多樣性和種群密度。

關(guān)鍵詞：巨大芽孢桿菌；16S rRNA；PCR?DGGE；腸道菌群；肉雞

動物每一個暴露于外界的部位，包括皮膚、口腔、呼吸道、泌尿生殖道和消化道均有大量的微生物定植，其中消化道是最密集的微生物定植器官［1］。而在動物消化道中，產(chǎn)乳酸的細菌是最主要的益生菌之一。乳酸可以降低胃腸道內(nèi)的pH，抑制大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等病原菌的生長，也具有活化消化酶、促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、促進腸道上皮生長等作用［2－3］。在人和動物組織內(nèi)只存在能夠代謝L－乳酸的L－乳酸脫氫酶［4］，因此，動物機體只能利用L－乳酸，不能代謝D－乳酸。目前，益生菌作為飼用抗生素的替代品越來越受到大家的重視，已有許多益生菌被篩選出來，并被廣泛應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中。通過實際生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)，乳酸菌雖對動物具有顯著的益生作用，但其效果不穩(wěn)定，且不耐高溫、不易保存、對外界環(huán)境敏感，這些缺點限制了其在生產(chǎn)實踐中的應用；而L－乳酸芽孢桿菌彌補了乳酸菌的不足，并且還能給動物機體提供可消化利用的L－乳酸，可以說它兼具了芽孢桿菌與乳酸菌的優(yōu)點。現(xiàn)在已有多種益生菌被制成微生態(tài)制劑用于促進動物的生產(chǎn)性能，提高飼料的利用率，增強機體的抗病能力［5］。但未見產(chǎn)L－乳酸芽孢桿菌對肉雞腸道菌群影響的報道。因此，本試驗擬對已分離的一株產(chǎn)L－乳酸芽孢桿菌BLZ01進行鑒定及乳酸消旋類型的鑒別；然后再利用動物試驗，采用聚合酶鏈式反應－變性梯度電泳技術(shù)（PCR?DGGE）技術(shù)觀察該菌株對肉雞腸道菌群的影響，為該菌的應用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1 菌種

芽孢桿菌BLZ01由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院發(fā)酵工程實驗室分離保存。

1．2 LB培養(yǎng)基

蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉浸膏5 g，酵母膏5 g，葡萄糖15 g，硫酸鎂0．2 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7．0～7．5，121℃滅菌30 min。如制作平板，加入2%瓊脂。

1．3 試劑和儀器設備

DL2000 DNA Marker，50 bp DNA Ladder，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；全血乳酸試劑盒（南京建成生工）。PCR儀，Dcode DGGE儀，BIO?RAD Laboratories（美國）。

1．4 菌種活化

將保存的芽孢桿菌BLZ01放入80℃水浴鍋中加熱10 min，在LB培養(yǎng)基上劃線活化，37℃培養(yǎng)36 h，觀察菌落形態(tài)、革蘭氏染色和鏡檢。

1．5 初步鑒定

參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》中芽孢桿菌屬的特性，對菌株BLZ01的菌落、細菌形態(tài)和生理生化特性進行鑒定，并用全血乳酸測試盒檢測菌株BLZ01培養(yǎng)液中的乳酸消旋類型。

1．6 16S rRNA序列分析

參照文獻［6］報道方法進行。

1．7 乳酸芽孢桿菌BLZ01活菌粉劑的制備

乳酸芽孢桿菌BLZ01通過菌種活化、淺盤固體培養(yǎng)、收集菌苔、加入粉碎并40目過篩的麩皮、干燥等制成乳酸芽孢桿菌BZL01活菌制劑，測定其活芽孢數(shù)量，調(diào)整含活芽孢數(shù)為2．0× 109CFU／g，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．8 動物分組及飼養(yǎng)

1日齡的艾維茵肉雞預喂至7日齡，選取健康的20羽，隨機分成2組，即對照組和試驗組，每組10只。對照組飼喂不含抗生素的基礎(chǔ)飼糧，試驗組飼喂基礎(chǔ)飼糧＋0．05 g／kg的乳酸芽孢桿菌BLZ01制劑，基礎(chǔ)飼糧組成參照文獻［7］。2組雞分別養(yǎng)于不同的雞籠內(nèi)，自由采食，自由飲水。

1．9 PCR?DGGE分析肉雞腸道菌群多樣性

肉雞飼養(yǎng)到42日齡時，停料12 h，每組隨機取5只，頸動脈放血處死，取肉雞回腸和盲腸段，準確稱取1 g腸道內(nèi)容物，置于10 mL滅菌離心管內(nèi)。按照張保衛(wèi)等［8］的方法提取內(nèi)容物中的總DNA，提取物定溶于20 μL TE溶液中。以等量的每組雞腸道細菌DNA提取物進行混合，并以之為模板，然后按文獻［9－10］的方法進行DGGE電泳。將得到的DGGE指紋圖譜用Quantity One軟件進行指紋圖譜分析和多樣性分析。

2　結(jié) 果

2．1 菌落及細菌形態(tài)特征

菌株BLZ01在培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，菌落呈乳白色而有光澤，表面濕潤，邊緣整齊，中央隆起；在生長后期菌落表面有皺褶，表面干燥，無光澤。革蘭氏陽性，顯微鏡下細胞呈直桿狀，常以成對或鏈狀排列，芽孢橢圓中生，液體培養(yǎng)時為需氧型。

2．2 生理生化特征

參考《伯杰細菌鑒定手冊》，乳酸芽孢桿菌BLZ01的生理生化特征見表1。根據(jù)菌落特征和顯微鏡下菌體的形態(tài)特征，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果和全血乳酸測試盒（南京建成生物工程研究所）對培養(yǎng)液中乳酸類型的鑒定結(jié)果，初步確定菌株BLZ01為一株產(chǎn)L－乳酸的巨大芽孢桿菌（Bacil?lus megaterium）。

2．3 16S rRNA的序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產(chǎn)物是一條大小約1．5 kb的特異性條帶。將PCR產(chǎn)物回收并測序，測得16S rRNA序列長度為1 463 bp。將得到的16S rRNA序列提交到NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進行BLAT在線分析，結(jié)果見表2。在NCBI獲得的登錄號為KP343685。

通過16S rRNA序列同源性比對，菌株BLZ01 與GenBank中前100個序列相似性均為99%，其中確切命名為巨大芽孢桿菌的就有46條序列。同時，在GenBank里搜索芽孢桿菌科內(nèi)9個不同屬的16S rRNA序列（登錄號可見進化樹），應用ClustalX 1．81軟件進行多重序列比對，再用Tree?View和Phylodraw軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建無根進化樹，結(jié)果見圖1。

表1　菌株BLZ01生理生化特征Table 1　Physiological and biochemical property of strain BLZ01

表2　菌株BLZ01 16S rRNA序列與GenBank中細菌菌株同源性比較Table 2　Compare the 16S rRNA sequence of strain BLZ01 with strains in GenBank

圖1中除菌株BLZ01、Bacillus cereus （JQ806056）、Bacillus thurinqiensis（KF935650）及4株Bacillus megaterium之外，其他菌株分別為芽孢桿菌科內(nèi)9種屬的模式菌株，其中Bacillus cere?us、Bacillus thurinqiensis、Bacillus subtili、Bacillus megaterium均屬于芽孢桿菌屬。從圖1中可以看出，菌株BLZ01與4株Bacillus megaterium距離最近，且都在同一個分支中，說明它們的親緣關(guān)系最近。再結(jié)合前面的菌落及細菌形態(tài)、生理生化特征以及相似性比較結(jié)果，最終確定菌株BLZ01是產(chǎn)L－乳酸的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

2．4 肉雞腸道菌群PCR?DGGE指紋圖譜分析

圖2為DGGE指紋圖譜，Marker為本實驗室保存的條帶數(shù)較多的腸道菌群樣品，CI和CC分別為對照組的回腸和盲腸樣品，TI和TC分別為試驗組的回腸和盲腸樣品。通過該圖可以看出，對照組及試驗組盲腸條帶數(shù)均多于回腸，且亮條帶也較多；肉雞飼喂巨大芽孢桿菌BLZ01后，試驗組的回腸、盲腸條帶數(shù)均多于對照組，且都出現(xiàn)了特異性條帶，如圖2中的4號和9號條帶；說明肉雞飼喂巨大芽孢桿菌BLZ01后腸道菌群多樣性及種群密度均有所增加。

圖1　BLZ01的系統(tǒng)進化樹Fig．1　The phylogenetic tree of BLZ01

圖2　肉雞腸道菌群PCR?DGGE指紋圖譜（泳道內(nèi)數(shù)字為回收條帶）Fig．2　PCR?DGGE fingerprint of intestinal microflora of broilers（the marked bands had been recovered）

2．5 PCR?DGGE檢測肉雞腸道菌群多樣性

利用Quantity One軟件對圖2的DGGE指紋圖譜進行定量分析，得到泳道／條帶識別圖（圖3）、相似性矩陣圖（圖4）和系統(tǒng)樹（圖5）。

圖3　泳道／條帶識別圖Fig．3　Compare lane images

圖4　相似性矩陣圖Fig．4　Similarity matrix of DGGE patterns

圖3中顯示共有40類條帶，22號、23號等9個條帶在每個樣品中均有出現(xiàn)，同時每個樣品均有自己的特異性條帶，10號、14號、37號和40號條帶也被視為特征性條帶，它們在某些樣品中的泳道中較粗，均被回收、純化和測序。通過圖3可以看出每個樣品的條帶數(shù)都不相同，TI有32個條帶，CI有22個條帶，CC有32個條帶，TC有35個條帶。再根據(jù)條帶比對結(jié)果，運用戴斯系數(shù)Cs法計算出各樣品的相似性，并得出相似性矩陣圖（圖4）。樣品間相似度最大的為59．6%（TI和CI），樣品間相似度最小的為27．6%（TI和TC）。利用UPGMA（unweighted pair group method with arith?metic averages）算法進行聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)樹（圖5）。系統(tǒng)樹圖5顯示4個樣品可分為兩大類，分別為TI和CI，CC和TC。

圖5　系統(tǒng)樹圖Fig．5　Clustering analysis of DGGE patterns

2．6 DGGE圖譜對應的腸道優(yōu)勢條帶DNA序列分析

分別選取對照組和試驗組的DGGE圖譜上的7個共性條帶和4個試驗組的特異性條帶，見圖2，共11條特征性條帶割膠回收，進行測序，在NCBI中進行BLAST，結(jié)果見表3?；厥盏臈l帶中，第2、3、4號均為乳桿菌；第6號條帶為鏈球菌，也是乳酸菌類型；其余條帶序列均為未培養(yǎng)的細菌。試驗組條帶種類與對照組相比，多出了第1、3、9、11號特異性條帶，這說明試驗組回腸、盲腸的菌群種類及數(shù)量發(fā)生了一定的變化。

3　討 論

3．1 菌株BLZ01的鑒定結(jié)果

NCBI數(shù)據(jù)庫中，關(guān)于巨大芽孢桿菌的基因序列有很多，只有少數(shù)序列涵蓋了巨大芽孢桿菌的完整基因，而不同菌種之間的相似性差異又很小，故僅通過16S rRNA基因序列相似性和系統(tǒng)進化樹分析的說服力不強。傳統(tǒng)的菌種鑒定包括菌落、菌體形態(tài)特征觀察和生理生化反應特征，由于鑒定內(nèi)容多，很多性狀都是基于感官來判斷的，主觀干擾很容易被引入，給鑒定工作帶來誤差［11］。因此本試驗先通過傳統(tǒng)的細菌形態(tài)特觀察和生理生化反應，結(jié)合培養(yǎng)液中乳酸類型的分析結(jié)果，可以初步判定菌株BLZ01為一株產(chǎn)L－乳酸的巨大芽孢桿菌。再通過16S rRNA基因序列相似性分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，該菌株在分類地位上的定位與巨大芽孢桿菌的形態(tài)特征、生理生化特征相符，且與其他4株巨大芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近，同源性達到了99%，且與NCBI中Ba?cillus megaterium DSM319相似性達到了99%，比對總分值達到了29 109。因此，本試驗可以確定菌株BLZ01為一株產(chǎn)L－乳酸的巨大芽孢桿菌。

表3　DGGE圖譜對應的單個條帶DNA序列Table 3　Sequences analysis of DNA recovered from single band in DGGE fingerprints

3．2 肉雞喂服芽孢桿菌BLZ01后對腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性的影響

動物腸道寄居著復雜的微生物，這些微生物具有菌群結(jié)構(gòu)多樣性的特性。目前，很多研究成果已證實腸道菌群結(jié)構(gòu)和宿主健康之間存在緊密的聯(lián)系［12］，這種聯(lián)系引起了人們對腸道微生物菌群如何構(gòu)建以及它們?nèi)绾斡绊懰拗鹘】捣矫娴膹娏遗d趣。由于許多因素影響雞腸道菌群組成，包括飼喂含有益生菌的飼料，故本試驗采用PCR?DGGE技術(shù)來分析肉雞飼喂巨大芽孢桿菌BLZ01后，用Quantity One定量分析回腸、盲腸細菌菌群結(jié)構(gòu)的變化及差異。

由于DGGE指紋圖譜中的一個條帶代表的是一種菌群，觀察得到的指紋圖譜，可以發(fā)現(xiàn)不同的條帶在不同的樣品中粗細度不一樣，條帶粗的，則對應的濃度較大，條帶細的，則對應的濃度較小，因此不同菌群在對照組與試驗組的不同腸道中的濃度存在差異，說明肉雞飼喂巨大芽孢桿菌BLZ01可以引起腸道內(nèi)菌群的濃度發(fā)生變化。運用Quantity One軟件對DGGE指紋圖譜進行泳道／條帶分析發(fā)現(xiàn)，對照組回腸、盲腸與Marker的相似度分別為43．2%和64．8%，試驗組回腸、盲腸與Marker的相似度分別為61．4%和60．5%，可見所有樣品與Marker相似度均比較低，這說明對照組與試驗組的不同腸道中的細菌群落結(jié)構(gòu)差異比較大。但樣品間也存在較多的共性條帶，如圖3中的22號、23號條帶，說明對照組與試驗組的不同腸道中也存在共同的菌群。將對照組和試驗組的電泳條帶進行聚類分析，兩兩對比可以發(fā)現(xiàn)，對照組回腸與試驗組回腸的相似度最大，為59．6%；其次對照組盲腸與試驗組盲腸相似度為55．6%；試驗組回腸與盲腸的相似度最小，為27．6%。進一步再構(gòu)建系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹中將對照組和試驗組樣品分為兩大類，即回腸為一類，盲腸為一類，這與相似度分析結(jié)果一致。這就表示，肉雞回腸、盲腸細菌菌群結(jié)構(gòu)差別比較突出，即使飼喂益生菌巨大芽孢桿菌BLZ01也不能改變這種差異。這與王秋菊等［13］研究的關(guān)于雛雞腸道菌群的PCR?DGGE分析結(jié)果相同。但是將相同腸道進行比較，回腸的相似度為59．6%，盲腸的相似度為55．6%，表明試驗組的回腸、盲腸與對照組回腸、盲腸的菌群結(jié)構(gòu)差異比較明顯，這就證實巨大芽孢桿菌BLZ01具有改變?nèi)怆u腸道內(nèi)菌群組成結(jié)構(gòu)的作用。同時，根據(jù)圖譜可以發(fā)現(xiàn)，試驗組的條帶數(shù)均多于對照組，與吳小盼等［13］報道的在肉雞飼糧中添加益生菌后，利用PCR?DGGE技術(shù)檢測不同腸段菌群多樣性的結(jié)果一致。且盲腸多于回腸，大部分盲腸條帶比回腸條帶較亮，與倪學勤［14］、Gong等［15］采用PCR?DGGE檢測蛋雞的腸道菌群DNA擴增結(jié)果相同。這就說明巨大芽孢桿菌BLZ01可以豐富肉雞腸道菌群種類。

研究表明，隨著雞腸道成熟化，腸道菌群從短暫而單一的構(gòu)成向復雜逐漸演化［16］。雞回腸微生物菌群構(gòu)建大概需要2周，而盲腸的構(gòu)建大概需要6～7周，隨后回腸和盲腸各自具有自己唯一的微生物菌群且是一種相對穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)［17］。故本試驗選擇了42日齡肉雞，并對其DGGE分離的7個共性條帶和4個試驗組的特異性條帶進行克隆測序。結(jié)果表明，肉雞腸道內(nèi)具有很多未培養(yǎng)出的細菌，已培養(yǎng)出的細菌是以乳桿菌屬為主，說明巨大芽孢桿菌BLZ01引起了肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。

4　結(jié) 論

①肉雞回腸、盲腸的腸道菌群存在較大差異，且以乳桿菌和未培養(yǎng)的細菌為主。

②肉雞飼喂芽孢桿菌BLZ01后，通過改變腸道內(nèi)菌群濃度和豐富菌群種類的方式，達到了改變?nèi)怆u腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用。因此我們認為，巨大芽孢桿菌BLZ01具有明顯提高肉雞腸道菌群的多樣性和種群密度的特點。

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Identification of a Lactic Acid?Producing Strain of Bacillus sp．BLZ01 and Its Influence on Intestinal Flora of Broiler

ZHANG Dongmei

1

PAN Kangcheng

1，2?

NI Xueqin

1，2

JING Bo

1

LIU Minggang

1

（責任編輯 武海龍）

（1．Research Center of Animal Microecology，College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2．Sichuan Province Key Laboratory of Animal Disease and Human Health，Chengdu 611130，China）

Abstract：The paper was conducted with the objective of identification of a lactic acid?producing strain of Ba?cillus sp．BLZ01 and its influence on the intestinal flora of the broiler．Combining the morphological，physio?chemical properties with 16S rRNA sequencing analysis，strain of Bacillus sp．BLZ01 was identified．Twenty 7?day?old broilers were randomly divided into 2 groups（each group included 10 broilers）．The control group was fed the basal diet．The experimental group was fed the basal diet supplemented with 0．05 g／kg of the BLZ01 probiotics．At the age of 42 days，the ileum and cecum microflora diversity of broilers were analyzed by polymerase chain reaction?denaturing gradient gel electrophoresis（PCR?DGGE）．The results showed as fol?lows：1）strain of BLZ01 was identified as Bacillus megaterium which could produce levolactic acid．2）The number of PCR?DGGE bands and concentration of the ileum and cecum microflora in broilers treated with Ba?cillus megaterium BLZ01 was siginificantly increased compared with that of control group．3）Lactobacillus sp．a(chǎn)nd uncultured bacteria were mainly appeared in the sequences of DNA recovered from single band in DGGE fingerprints by identified．The results indicated that strain of Bacillus BLZ01 is Bacillus megaterium which can produce levolactic acid；the abundance and population density of intestinal microflora in broiler treated with Ba?cillus megaterium BLZ01 are increased．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（7）：2193?2200］

Key words：Bacillus megaterium；16S rRNA；PCR?DGGE；intestinal microflora；broiler

Corresponding author?，professor，E?mail：pankangcheng71＠126．com

通信作者：?潘康成，教授，博士生導師，E?mail：pankangcheng71＠126．com

作者簡介：張冬梅（1987—），女，四川達州人，碩士，從事動物微生態(tài)的研究工作。E?mail：zhangdongmeicy＠163．com

基金項目：“教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”創(chuàng)新團隊資助項目（IRT0848）

收稿日期：2015－01－30

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．07．025

文章編號：1006?267X（2015）07?2193?08

文獻標識碼：A

中圖分類號：S831