基于SERS-MIT 的食源性毒芹堿快檢研究

郭靖雯，辛美果

（1.廣州工商學院粵港澳大灣區(qū)智慧冷鏈產(chǎn)業(yè)學院，廣東佛山 528135；2.佛山科學技術(shù)學院 食品科學與工程學院，廣東 佛山 528000）

毒芹堿通常以毒芹堿鹽的形式存在于毒芹菜等植物中，具有強毒性以及致畸作用［1］。毒芹堿的致死量為60～120 mg，分子式為C8H17N，分子質(zhì)量為127.23%［2］，分子結(jié)構(gòu)如圖1 所示。毒芹菜由于外形與芹菜、茴香等可食用植物相似，經(jīng)常由于誤食而引起毒芹堿中毒。古希臘哲學家蘇格拉底因飲用毒芹堿混合物而死亡［3］。研究表明，毒芹堿對周圍和中央突觸傳遞存在影響，臨床表現(xiàn)通常為神經(jīng)毒性中毒，橫紋肌溶解和急性腎小管壞死［4］。Okan 等［5］通過研究毒芹堿在小鼠抗痛活性實驗中，得出了毒芹堿可通過煙堿受體作用從而具有抗痛作用的研究結(jié)果，提出并驗證了關(guān)于蘇格拉底因食用毒芹堿的混合物而無痛死亡的藥理學評估。2009 年，李蓮婷［6］報告了5 例急性毒芹中毒。盡管有關(guān)誤食毒芹中毒的文獻報道不多，但在基層醫(yī)院中，這種情況并不罕見。

目前可查閱文獻中針對毒芹堿有效檢測的研究相對較少，Lopez 等［7］實驗采用薄層色譜法（Thin-LayerChromatography，TLC）對毒芹堿進行檢測，定量限為0.8 μ g/mL。Beyer 等［8］的實驗檢測方法中，首先對毒芹堿使用固相萃取法進行萃取，再用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進行檢測和定量。上述檢測方法解決了毒芹堿的檢出問題，但存在前處理復雜，檢測限量低等問題。

圖1.1 毒芹堿的分子結(jié)構(gòu)圖

表面增強拉曼光譜技術(shù)（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS），是利用增強基底以實現(xiàn)對拉曼信號的顯著增強的分析方法?；诶庾V技術(shù)，可研究不同物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)、分子振動模式和化學鍵的性質(zhì)［9］。相較于其他光譜學技術(shù)，拉曼光譜技術(shù)可以對樣品進行非損壞分析，且不需要對樣品進行特殊處理，同時具有高靈敏度、高分辨率、快速測量、不受水分子干擾等優(yōu)點。分子印跡技術(shù)（Molecular Imprinting Technique，MIT）是具有特異性識別能力的高分子材料的技術(shù)，這些高分子材料通常被稱為分子印跡聚合物（Molecularly Imprinted Polymers,MIPs）［10］?；诜肿佑〖夹g(shù)所制備的分子印跡聚合物具有模板預(yù)定性，即在聚合物制備過程中使用的模板分子可以確定所制備聚合物的結(jié)構(gòu)和空穴。分子印跡技術(shù)具備高特異性吸附能力和良好的化學穩(wěn)定性，與SERS 技術(shù)聯(lián)用進行檢測，不僅可以避免其他污染物的干擾，還可以提高SERS 的檢測靈敏度，并為痕量生物堿的檢測提供了一條新的途徑。目前國內(nèi)關(guān)于分子印跡技術(shù)聯(lián)合表面增強拉曼光譜技術(shù)檢測的相關(guān)研究涉及環(huán)境污染物檢測［11］、醫(yī)學藥品［12］、農(nóng)藥殘留檢測［13］等領(lǐng)域，LIKUN 等［14］通過制備新的便攜式分子印跡聚合物SERS-MIT 納米探針，并成功用該探針檢測出茶飲料中的可可堿和咖啡因的類似物模板茶堿，其回收率為99.0～102.0%。Hu 等［15］采用分子印跡聚合物顆粒加載銀納米顆粒（AgNPs），開發(fā)了基于高性能表面增強拉曼散射的水生基質(zhì)中咖啡因的快速和單步檢測技術(shù)。因此本文在已有研究的基礎(chǔ)上，運用SERS-MIT 技術(shù)對毒芹堿建立快速檢測方法，希望能為后續(xù)研究提供技術(shù)參考和文獻支持。

1 實驗方法

1.1 實驗材料與試劑

本實驗所用到的實驗試劑如表1 所示，實驗用水均為超純水。實驗主要儀器如表2 所示。實際樣品包括芹菜、蘋果和毒芹堿菜均購于佛山市南海區(qū)大瀝鎮(zhèn)顏峰市場。

表1 實驗試劑

表2 實驗儀器

1.2 實驗過程

1.2.1 納米銀溶膠的配置

分別準確稱取0.169 9±0.000 1 g 硝酸銀固體，0.069 5±0.000 1 g 鹽酸羥胺固體，0.400 0±0.000 1 g氫氧化鈉固體，后轉(zhuǎn)移至不同棕色容量瓶中加超純水定稀釋容至100 mL，從而獲得0.01 mol/L 的硝酸銀溶液，0.01 mol/L 的鹽酸羥胺溶液以及0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液。將上述配置所得的硝酸銀溶液與鹽酸羥胺溶液1∶1 混合，加入1 滴氫氧化鈉溶液，搖勻后避光密封保存，注意納米銀溶膠應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 毒芹堿標準溶液的配置

毒芹堿1×10-1mol/L 標準溶液的配置：由于毒芹堿易溶于水，因此采用超純水作為溶劑。使用萬分之一天平準確稱取0.012 7±0.000 1 g 毒芹堿固體，轉(zhuǎn)移至潔凈的帶蓋棕色試劑瓶內(nèi)，加入1 ml 的超純水，搖勻。繼續(xù)用超純水依次稀釋至1×10-2mol/L～1×10-8mol/L，分別獲得毒芹堿各濃度梯度標準溶液，密閉保存于棕色試劑瓶內(nèi)，并放置于2～8 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.3 樣品處理

將芹菜和蘋果等樣品洗凈、擦干、破碎；繼續(xù)在不同食品基質(zhì)中分別加標5 μL 毒芹堿各濃度梯度標準溶液，充分混合后，用離心機以2 000 rpm 離心5 min，取上清液，密封避光保存待用。原始樣品毒芹菜直接破碎，過濾后取汁液，密封避光保存，檢測時直接使用即可。

1.4 分子印跡聚合物的制備

采用預(yù)組裝共價印跡法，以0.01 mol/L 的毒芹堿為模板分子，加入10 mL 致孔劑（乙腈）和314 μL功能單體（甲基丙烯酸），振蕩搖勻并超聲分散15 min。隨后加入配比為4∶1 的混合交聯(lián)劑（二乙烯基苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯）。然后加入6.2 mg 的引發(fā)劑（偶氮二異丁腈），充分混合并經(jīng)5 min 超聲分散，通入高純氮氣并后密封。在60～65 ℃恒溫水浴中進行24 h 恒溫熱聚合反應(yīng)。反應(yīng)完成后，在4 000 rpm轉(zhuǎn)速下離心2 min，再經(jīng)0.45 μm 有機濾膜過濾，在60 ℃真空干燥箱中干燥8 h，得到白色粉末狀的聚合物。繼而，使用醋酸和甲醇（1∶9）作為索氏提取劑，對得到的聚合物進行索氏提取24 h，從聚合物中洗脫模板分子。并通過SERS 技術(shù)對已洗脫的聚合物進行拉曼信號檢測，以確定其不含模板分子。采集已洗脫的高分子微粒，置于真空干燥箱中60 ℃干燥24 h，最終獲得白色粉末狀的毒芹堿分子印跡聚合物（Coniine-MIPs）。非分子印跡聚合物（Non-Molecularly Imprinted Polymers，NIPs）的合成過程相同，但未加入2 種模板分子。

1.5 掃描電鏡表征

將分子印跡聚合物白色粉末制備成合適大小的樣品，并在室溫下干燥。將樣品放置于掃描電鏡（SEM）采樣臺上，使用金屬導電膠將樣品固定在SEM采樣臺上，使樣品與SEM采樣臺接觸并獲得導電性。在觀察過程中，可以適當調(diào)整SEM參數(shù)，以獲取最佳的SEM圖像。根據(jù)SEM圖像和觀察結(jié)果，對樣品的形貌和結(jié)構(gòu)進行分析。

1.6 表面增強拉曼光譜的采集

稱取0.5 mg 所制得的Coniine-MIPs 溶于0.5 mL 各目標待檢溶液，如毒芹堿各濃度梯度標準溶液，以及食品基質(zhì)加標目標溶液和原始樣品汁液等。將樣品在室溫下恒溫振蕩吸附1 h。然后將樣品放入離心機中，并將轉(zhuǎn)速設(shè)置為4 500 rpm，離心2 min，然后取底部的MIPs。使用超純水將聚合物清洗3 次，以去除其表面的毒芹堿。繼而將MIPs 置于干凈的載玻片上，滴加足量的納米銀溶膠以完全覆蓋樣品，混合，避光反應(yīng)1 h 后，使用拉曼儀進行檢測，選擇532 nm 激光波長，將激光強度設(shè)置為50%，激光照射光斑的直徑為200 μm，光柵直徑為500 nm，同時選用50 倍物鏡共聚焦顯微鏡。在聚合物的10 個不同位置進行測量，并取平均值。

1.7 分子印跡聚合物吸附性能研究

1.7.1 靜態(tài)吸附實驗

配制一系列不同濃度的（0.0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 mg·mL-1）毒芹堿溶液，準確稱取3 mg 的MIPs 或NIPs 加入3 mL 上述標準溶液中，使用恒溫振蕩搖床在常溫下避光振蕩1 h。在4 500 rpm 轉(zhuǎn)速下離心2 min，取上清液。使用紫外分光光度計對毒芹堿標準溶液在300～750 nm 波長下進行紫外掃描，記錄毒芹堿的最大吸收波長為235 nm。并對吸附前一系列濃度溶液進行吸光度測量，繪制標準曲線，用于計算樣品溶液中目標物質(zhì)的濃度。測量吸附后溶液的吸光度，并計算出吸附前后溶液中目標物質(zhì)的濃度差，通過公式（1）對吸附量進行計算，分析吸附實驗前后溶液中目標物質(zhì)量的變化。

式中，Qe為平衡時的吸附量（mg·g-1），C0為標準溶液的初始濃度（mg·mL-1），Ce為標準溶液的平衡濃度（mg·mL-1），V 為溶液體積（L），m 為吸附劑質(zhì)量（g）。

1.7.2 動態(tài)吸附實驗

配制3 mL 濃度為1.5 mg·mL-1的毒芹堿溶液，將3 mg 的Coniine-MIPs 分散到上述溶液中。樣品在室溫下避光振蕩0、10、20、30、40、60、90 和120 min，然后在4 500 rpm 轉(zhuǎn)速下離心2 min，取上清液。使用紫外分光光度計在235 nm 處測定目標生物堿的含量。根據(jù)公式（2）和（3）采用準一級動力學方程和準二級動力學方程，進一步對Coniine-MIPs 和Ricinine-MIPs 的吸附動力學進行研究。

式中，Qe為平衡時的吸附量（mg/g），Qt為時間t 的吸附量，K1和K2分別為偽一階和二階吸附過程的速率常數(shù)。

1.7.3 重復利用實驗

準確稱取3 mg 毒芹堿聚合物粉末，分散于3 mL 的毒芹堿1.5 mg·mL-1溶液中。置于恒溫搖床在室溫下避光搖勻1 h，在4 500 rpm 轉(zhuǎn)速下離心2 min，取上清液，檢測其吸附量。繼而進行解附實驗，即使用索氏提取法對已完成吸附實驗的分子印跡聚合物進行目標模板分子洗脫24 h，通過SERS 技術(shù)檢測已洗脫目標分子的聚合物，確定其不含模板分子。繼續(xù)進行下1 次的吸附實驗。對以上吸附-解附實驗重復5 次，從而觀察分子印跡材料的吸附變化情況及判斷其使用穩(wěn)定性。

2 結(jié)果討論與分析

2.1 毒芹堿的理論拉曼光譜計算

基于密度泛函理論，采用B3LYP/6-31++G（d，p）基組對其結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，并計算了毒芹堿分子的振動頻率［16］。優(yōu)化后的毒芹堿空間結(jié)構(gòu)如圖2a 所示，毒芹堿分子主要由C-C、C-N、C-H 和N-H 等基團組成。無產(chǎn)生虛頻現(xiàn)象，則優(yōu)化后的毒芹堿分子結(jié)構(gòu)為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)［17］。運用密度泛函理論計算優(yōu)化后的毒芹堿理論拉曼圖譜與實際毒芹堿的SERS 圖譜如圖2b 所示。本研究在毒芹堿檢測過程中發(fā)現(xiàn)，物質(zhì)拉曼特征峰的拉曼強度過低或噪聲過高都容易導致毒芹堿拉曼特征峰無法被有效的檢出，因此本實驗分析針對實驗獲得的SERS 圖譜，運用KnowItAll 光譜解析軟件中的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，選擇圖譜中拉曼強度大于5%，噪聲小于2%的拉曼峰作為毒芹堿的拉曼特征峰進行分析，有效確保了在后續(xù)實驗及實際檢測應(yīng)用中毒芹堿的高檢出率及高準確率。使用VEDA4 結(jié)合PED 對毒芹堿的分子振動歸屬進行計算，分析結(jié)果如表3 所示，毒芹堿分子振動模式主要包括3 種，分別為：伸縮振動（Stretching Vibration，STRE）、彎曲振動（Bending Vibration，BEND）以及扭轉(zhuǎn)振動（Torsion Vibration，TORS）。確定毒芹堿的拉曼特征峰為：796 cm-1、1 012 cm-1、1037 cm-1、1 455 cm-1、2 869 cm-1、2 904 cm-1、2 935 cm-1和2 959 cm-1。分別 對 應(yīng)理論特征峰808 cm-1、1 012 cm-1、1 037 cm-1、1 496 cm-1、3 000 cm-1、3 016 cm-1、3 032 cm-1和3 064 cm-1。實際峰與計算峰的峰型基本相符，但峰位和峰強度略有差異。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因為：在理論計算中，分子被認為是氣態(tài)分子，忽略了分子間的作用力。然而，在實際實驗中，納米銀顆粒會與樣品相互吸附，引發(fā)誘導性反應(yīng)，改變了樣品分子內(nèi)的電荷分布，從而導致分子振動模式和峰位的變化。

表3 毒芹堿分子振動歸屬計算結(jié)果

圖2 芹堿分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化圖與毒芹堿實驗和理論拉曼光譜圖

2.2 分子印跡聚合物的表征

圖3a 和3b 分別展示了毒芹堿分子印跡聚合物和空白非分子印跡聚合物在掃描電鏡下的表面形貌。其中Coniine-MIPs 呈凹凸不平的粗糙球狀，這可能與物質(zhì)表面存在大量與模板分子的結(jié)合位點有關(guān)。NIPs 呈表面光滑球狀。

圖3 Coniine-MIPs 與NIPs 的掃描電鏡圖

2.3 分子印跡聚合物吸附性能研究

2.3.1 靜態(tài)吸附實驗結(jié)果

為了解吸附材料對目標吸附物質(zhì)的親和力，對Coniine-MIPs 以及NIPs 進行吸附容量及吸附率分析。吸附量通過公式（1）進行計算。圖4 展示了Coniine-MIPs 和NIPs 的靜態(tài)吸附曲線。實驗結(jié)果顯示，Coniine-MIPs 吸附量Qe 隨著目標化合物的初始濃度增加而增加，當初始濃度達到1.5 mg·mL-1時，到達吸附平衡狀態(tài)。最大吸附容量為1.4 mg·g-1，吸附率為95.3%。NIPs 隨著目標化合物的初始濃度的增加，吸附量Qe緩慢增加，當濃度到達0.9 mg·mL-1時，到達吸附平衡狀態(tài)，最大吸附容量為0.06 mg·g-1，吸附率為6.7%。說明Coniine-MIPs 具有良好的吸附能力，而NIPs 吸附能力極弱。

圖4 Coniine-MIPs 的靜態(tài)吸附曲線

2.3.2 動力學吸附分析

物質(zhì)的吸附動力學可以反映待檢分子在聚合物材料表面上的吸附速率、覆蓋度等動力學參數(shù)。分子印跡聚合物的動態(tài)吸附曲線如圖5a 所示，Coniine-MIPs 的吸附量均隨溶液濃度的增加而增加，當時間到達60 min 時，吸附速率減緩，基本達到吸附平衡。繼續(xù)使用準一級（2）和準二級（3）動力學方程式，進一步模擬Coniine-MIPs 對毒芹堿分子的吸附動力學過程。如圖5b 所示，Coniine-MIPs 的準一級動力模型的R2值0.842 8，吸附速率常數(shù)K1為0.29 mg/g/min。準二級動力模型的R2分別為0.9245，吸附速率常數(shù)K2為0.25 mg/g/min。與準一級動力模型相比，準二級動力模型的Qe值更接近實驗測量的吸附量。綜上所述，準二級動力學模型更好地對實驗數(shù)據(jù)進行了擬合，因此Coniine-MIPs 的吸附過程遵循準二級動力學機理，聚合物對目標模板分子的吸附是基于化學吸附的速率限制過程，更有效地預(yù)測了整個吸附行為。

圖5 Coniine-MIPs 的動態(tài)吸附曲線及準一級動力學和準二級動力學模型圖

2.3.3 重復利用實驗

Coniine-MIPs 的重復利用實驗結(jié)果如圖6 所示。以初次目標待檢物的吸附量為標準對比，經(jīng)5 次吸附-解附循環(huán)后，Coniine-MIPs 的吸附量雖然略微下降，但到達第5 次循環(huán)時，Coniine-MIPs 對目標待檢物的吸附率仍有初始值的85%。意味著這種分子印跡聚合物的可重復使用次數(shù)至少在5 次以上，聚合物具備較高的使用穩(wěn)定性。

圖6 Coniine-MIPs 的重復利用實驗

2.3.4 光譜檢測重現(xiàn)性結(jié)果

使用Coniine-MIPs 對1×10-4mol/L～1×10-8mol/L 各濃度梯度毒芹堿標準溶液進行模板分子的吸附，并進行SERS 檢測，實驗結(jié)果如圖7 所示。毒芹堿的最低檢出濃度為1×10-8mol/L，檢出限為1.27 μg/L。圖8 展示了吸附目標物質(zhì)后的Coniine-MIPs 在2 869 cm-1檢測位點的光譜重現(xiàn)性和RSD 值。在這些實驗中，Coniine-MIPs 分別吸附了1×10-4mol/L～1×10-8mol/L 各濃度的毒芹堿標準溶液，并收集SERS 光譜。結(jié)果表明，2 869 cm-1檢測位點的拉曼峰強的RSD 值在2.08%～6.47%之間。結(jié)果表明，吸附后的Coniine-MIPs 的拉曼光譜具有良好重現(xiàn)性。

圖7 Coniine-MIPs 吸附毒芹堿的標準溶液SERS 光譜

圖8 計算吸附各濃度溶液的Coniine-MIPs 在2 869 cm-1 檢測位點的拉曼峰強度和RSD 值

2.3.5 實際檢測中的應(yīng)用

為了驗證SERS-MIT 技術(shù)的檢測穩(wěn)定性，分別對加入毒芹堿標準溶液的蘋果和芹菜樣品以及毒芹菜樣品進行檢測。結(jié)果如圖9a～9c 所示，從圖中可明顯的看出Coniine-MIPs 能有效吸附蘋果和芹菜基質(zhì)中的毒芹堿分子，且通過SERS 技術(shù)能采集到毒芹堿分子位于796 cm-1、1 012 cm-1、1 037 cm-1、1 455 cm-1、2 869 cm-1、2 904 cm-1、2 935 cm-1和2 959 cm-1處的8 個拉曼特征峰，并能有效采集加標1×10-6mol/L 毒芹堿標準溶液的蘋果和芹菜樣品的SERS 光譜Coniine-MIPs 對毒芹菜中目標分子進行了有效的特異性吸附，并通過SERS 技術(shù)分別準確檢出了歸屬于毒芹堿的8 個拉曼特征峰。

圖9 Coniine-MIPs 吸附蘋果基質(zhì)和芹菜基質(zhì)加標毒芹堿各濃度標準溶液的SERS 光譜圖以及Coniine-MIPs 吸附毒芹菜中毒芹堿的SERS 光譜圖

3 結(jié)論與展望

有毒生物堿引起的食源性疾病是全球性的衛(wèi)生安全問題。由于有毒生物堿在檢測中具有含量低、毒性大的特點，加之食品基質(zhì)組分復雜，給準確檢測帶來了困難。因此目標生物堿的有效分離和靈敏檢測逐漸成為研究的熱點和難點。本研究就上述問題，以毒芹堿為例，構(gòu)建SERS-MIT 聯(lián)用檢測法。使用鹽酸羥胺還原硝酸銀法制備高靈敏度SERS 增強基底。采用預(yù)組裝共價印跡法制備毒芹堿的分子印跡聚合物及非分子印跡聚合物，通過SEM表征獲悉了MIPs 為表面具有大量與模板分子結(jié)合位點的粗糙球狀物質(zhì)，NIPs 為較為光滑的球狀體；Coniine-MIPs 對毒芹堿的最大吸附容量為1.43 mg·g-1，吸附率為95.3%；而NIPs 的最大吸附容量為0.06 mg·g-1，吸附率為6.7%，表明NIPs 吸附能力極弱。動態(tài)吸附實驗結(jié)果顯示，Coniine-MIPs 吸附過程遵循準二級動力學機理，聚合物對目標模板分子的吸附是基于化學吸附的速率限制過程；重復利用實驗結(jié)果顯示，到達第5 次循環(huán)時，Coniine-MIPs 的吸附率仍有初始值的85%，至少可重復使用5 次以上。實際應(yīng)用檢測結(jié)果顯示，Coniine-MIPs 對毒芹堿標準溶液的最低檢出濃度為1×10-8mol/L。2 869 cm-1檢測位點的拉曼峰強的RSD 值在2.08 %～6.47 %之間。表明SERS-MIT 聯(lián)用技術(shù)檢測毒芹堿分子的拉曼光譜具備良好靈敏度及重現(xiàn)性；SERS-MIT 聯(lián)用檢測技術(shù)能有效地對毒芹菜中的毒芹堿進行效吸附，并能通過SERS 檢測采集到完整的毒芹堿分子拉曼特征峰。以上實驗結(jié)果表明，SERS-MIT 聯(lián)用技術(shù)檢測毒芹堿具有較好的吸附和檢測能力以及良好的靈敏度和準確性。SERS-MIT 聯(lián)用技術(shù)實現(xiàn)了對復雜基質(zhì)中目標生物堿的特異性吸附以及穩(wěn)定性檢測。解決了有毒生物堿檢測的安全性及高效性問題。這項技術(shù)的成功應(yīng)用，將有助于提高含有毒生物堿植物的檢測和鑒別能力，對于保障食品安全和人們健康具有重要的意義。