處理高濃度DDNP廢水的白腐真菌培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

王明龍

（山西清澤陽光環(huán)?？萍加邢薰?，山西 太原 030012）

白腐真菌（white rot fungus）是一類腐生的絲狀真菌，由于其分泌的胞外木質(zhì)素降解酶具有非特異性和無需底物誘導(dǎo)的獨特性能，使得它對許多結(jié)構(gòu)不同、高毒性、高分子難降解有機物具有廣譜的降解能力，能降解包括多環(huán)芳烴化合物、氯代芳烴化合物、農(nóng)藥、染料以及炸藥廢水等在內(nèi)的多種環(huán)境污染物，在很多方面具有重要的應(yīng)用價值［1-4］。同時，固定化細胞技術(shù)在廢水處理中有處理效率高、穩(wěn)定性強、生物密度高、反應(yīng)啟動快、抗逆性強、耐毒性、耐高負荷、產(chǎn)污泥量少、固液分離簡單、菌體可循環(huán)利用等優(yōu)點。因此，將兩者優(yōu)點結(jié)合起來的固定化白腐真菌培養(yǎng)及降解技術(shù)在環(huán)境保護領(lǐng)域更具生產(chǎn)實踐意義［5］。

近年來，固定化白腐真菌培養(yǎng)及降解技術(shù)越來越多地受到世界各國科學(xué)界及工業(yè)界的高度重視，它們在環(huán)境保護領(lǐng)域正顯示出誘人的應(yīng)用前景。因此，對白腐真菌的深入研究有著重要的理論價值和實際意義，并且已成為世界各國環(huán)境保護領(lǐng)域又一新的研究熱點［6-8］。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本實驗所用的白腐真菌是從生物研究所購買。

培養(yǎng)基所需試劑：葡萄糖、酒石酸銨、維生素B1、KH2PO4、NaHPO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4、ZnSO4·7H2O、NaCl、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉。

調(diào)節(jié)pH的試劑：4%的鹽酸溶液，5%的氫氧化鈉溶液。

1.2 儀器設(shè)備

AL204-1C（萬分之一）電子分析天平；無菌接種操作室和接種環(huán)；手提式蒸汽消毒器，YXQ-LS-SII大型臺式滅菌鍋；電動離心機；AL204-1C（千分之一）電子分析天平；柜式培養(yǎng)箱；SPX-150-D振蕩培養(yǎng)箱。

1.3 培養(yǎng)基

1）白腐真菌的固體培養(yǎng)基：葡萄糖10g，瓊脂15g～20g，酒石酸銨 0.4g，KH2PO43g，NaHPO40.2g，MgSO40.25g，維生素B1 0.005g，CaCl20.1g，F(xiàn)eSO40.1g，ZnSO4·7H2O 0.03g，MnSO40.002g。

2）白腐真菌的液體培養(yǎng)基（搖床發(fā)酵液體培養(yǎng)基）：葡萄糖10g，酒石酸銨0.4g，KH2PO43g，NaHPO40.2g，MgSO40.25g，維生素B1 0.005g，CaCl20.1g，F(xiàn)eSO40.1g，ZnSO4·7H2O 0.03g，MnSO40.002g。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 培養(yǎng)基的制備

1）按照固體和液體的培養(yǎng)基成分用萬分之一分析天平稱好藥品，倒入燒杯中，并用蒸餾水定容到標(biāo)線。

2）用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值，采用pH試紙來判斷pH值。

3）將用來制備固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿用報紙包好和培養(yǎng)液放入臺式蒸汽鍋中，在115℃下殺菌20min。將用來制備液體培養(yǎng)基的含有培養(yǎng)液的燒杯放入蒸汽消毒器，在121℃下殺菌20min。

4）固體培養(yǎng)基：消毒后，將培養(yǎng)液趁熱倒入培養(yǎng)皿中，放置在無菌環(huán)境中備用。

5）液體培養(yǎng)基：待冷卻后倒入培養(yǎng)瓶，放在無菌環(huán)境中待用，等溫度降到30℃再接種［9-13］。

1.4.2 微生物生長量的測量方法

本實驗中在測量白腐真菌時采用了直接測量的方法，通過測其濕重來判斷它在該培養(yǎng)基中的生長量。具體測法：用分析天平（千分之一）測量4個離心瓶的質(zhì)量。將培養(yǎng)好的白腐真菌液體培養(yǎng)液分組，每4個1組。每次測4個，每2個用托盤天平配平。放入離心機中，設(shè)定好轉(zhuǎn)速和時間（4 000r/min，20min），開始離心。離心后，將上清液倒掉，用分析天平（千分之一）測量其質(zhì)量，并記錄。

2 結(jié)果與討論

本實驗的液體培養(yǎng)基為白色懸浮液，經(jīng)過48h的培養(yǎng)，白腐真菌逐漸成型，出現(xiàn)部分孢體。而經(jīng)過96h的培養(yǎng)，菌液中出現(xiàn)孢子狀菌體，菌體比較舒展，可用肉眼觀察其長勢。

在本實驗中采用葡萄糖的最佳質(zhì)量濃度為10g/L，選取轉(zhuǎn)速為120r/min，ZnSO4最佳質(zhì)量濃度是 0.03g/L，MnSO4的 最 佳 質(zhì) 量 濃 度 為0.001 7g/L［14］。

2.1 各單因素對白腐真菌生長量的影響

2.1.1 pH值對生長量的影響

白腐真菌的最佳培養(yǎng)溫度為30℃～40℃。查閱資料可以發(fā)現(xiàn)，在這個溫度段，溫度對菌體的影響不是很大，所以選擇的溫度為37℃。將pH值分成6個水平分別進行實驗。經(jīng)過培養(yǎng)和測試，得出表1的結(jié)論。白腐真菌在酸性環(huán)境中生長較好，堿性環(huán)境抑制該菌的生長；但過量的酸性也會抑制白腐真菌的生長。白腐真菌的最適生長pH值為4.5。

表1 pH值與生長量的關(guān)系

2.1.2 酒石酸銨質(zhì)量濃度對生長量的影響

溫度為37℃，將液體培養(yǎng)基中的酒石酸銨分成6個質(zhì)量濃度梯度進行實驗。經(jīng)過培養(yǎng)和測定，得出表2的結(jié)論。酒石酸銨是培養(yǎng)基中的氮源，沒有酒石酸銨，白腐真菌的生長效果很不好。但是，隨著酒石酸銨質(zhì)量濃度的增加，白腐真菌的生長量出現(xiàn)了一個峰值；過了峰值，生長量又隨著濃度的增加而減小。所以，酒石酸銨的最佳質(zhì)量濃度為0.6g/L。

表2 酒石酸銨質(zhì)量濃度與生長量的關(guān)系

2.1.3 磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度對白腐真菌的影響

溫度為37℃，將培養(yǎng)基中的磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度分成6個水平進行實驗。經(jīng)過培養(yǎng)和測定，得出表3的結(jié)論。起初，白腐真菌的生長量隨著磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度的增加而增加，在質(zhì)量濃度為4g/L時生長量最大；過了最大值，生長量隨著質(zhì)量濃度的增加而減小。所以，磷酸二氫鉀的最佳質(zhì)量濃度為4g/L。

表3 磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度與生長量的關(guān)系

2.1.4 磷酸一氫鈉質(zhì)量濃度對生長量的影響

室溫為37℃，將培養(yǎng)基中的磷酸一氫鈉的質(zhì)量濃度分成6個水平，將等量的白腐真菌接種在6個培養(yǎng)基中。經(jīng)過培養(yǎng)和測定，得出表4的結(jié)論。隨著磷酸一氫鈉質(zhì)量濃度的增加，白腐真菌的生長量增加，在0.2g/L時得到最大值；隨后，隨著質(zhì)量濃度的增加，生長量減少。所以，磷酸一氫鈉的最佳質(zhì)量濃度為0.2g/L。

表4 磷酸一氫鈉質(zhì)量濃度與生長量的關(guān)系

2.1.5 硫酸鎂質(zhì)量濃度對白腐真菌生長量的影響

室溫為37℃，將培養(yǎng)基中的硫酸鎂分成6個水平進行實驗，得出表5的結(jié)論。最佳硫酸鎂的質(zhì)量濃度為0.4g/L。但是，硫酸鎂對白腐真菌的生長影響不是特別明顯，還有待進一步研究，所以不對其進行正交化。

表5 硫酸鎂質(zhì)量濃度與生長量的關(guān)系

2.1.6 氯化鈣質(zhì)量濃度對生長量的影響

室溫為37℃，將培養(yǎng)基中的氯化鈣分成6個水平進行實驗。經(jīng)過培養(yǎng)和測定，得出表6的結(jié)論。隨著氯化鈣質(zhì)量濃度的增加，白腐真菌的生長量減少。所以，氯化鈣對白腐真菌有一定的抑制作用，對白腐真菌的生長不利。

表6 氯化鈣質(zhì)量濃度與生長量的關(guān)系

2.2 正交實驗

2.1 實驗探討了各單因素（pH、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸一氫鈉、硫酸鎂、氯化鈣）對白腐真菌生長量的影響，初步確定了單個實驗條件值，它只能反映單個實驗因素作用下白腐真菌生長量的變化趨勢。因此，為了探討在各因素綜合作用下白腐真菌處理高濃度DDNP廢水的最佳培養(yǎng)基條件，本實驗以葡萄糖（A）為碳源，磷酸二氫鉀（B）、磷酸一氫鈉（C）為磷源，酒石酸銨（D）為氮源，采取4因素3水平（見表7）正交實驗的方法對白腐真菌液體培養(yǎng)基進行優(yōu)化。正交實驗結(jié)果見表8。

表7 L9（34）正交實驗因素和水平

表8 L9（34）正交實驗結(jié)果分析

按照正交實驗表8配出9個培養(yǎng)基，分別接種相同量的菌體，培養(yǎng)5d后，稱量菌體的濕重，并記錄。通過表8可以看出，4號瓶的生長量最大。所以，最佳配比即為 A2B1C2D3，即葡萄糖10g/L，酒石酸銨0.7g/L，磷酸一氫鈉0.2g/L，磷酸二氫鉀1g/L。

3 結(jié)論

對有效處理高濃度DDNP廢水的白腐真菌培養(yǎng)基的優(yōu)化實驗研究可知，pH、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸一氫鈉、硫酸鎂、氯化鈣對白腐真菌培養(yǎng)基中的生長量皆有影響；最佳的碳源、氮源和磷源為葡萄糖、酒石酸銨和磷酸二氫鉀及磷酸一氫鈉；白腐真菌培養(yǎng)基優(yōu)化的最佳配比為：葡萄糖10g/L，酒石酸銨0.7g/L，磷酸二氫鉀1g/L，磷酸一氫鈉0.2g/L，硫酸鎂0.4g/L，VB1 0.005g/L，硫酸亞鐵0.1g/L，硫酸鋅0.03g/L，硫酸錳0.005g/L。

利用白腐真菌處理高濃度DDNP廢水具有明顯的經(jīng)濟效益和社會效益，在工業(yè)中已經(jīng)利用白腐真菌來處理高濃度DDNP廢水。結(jié)果顯示，它不僅能降解硝基苯，還能降解硝基苯的次級代謝產(chǎn)物，說明白腐真菌可以完全降解硝基苯［15-20］。因此，對白腐真菌培養(yǎng)基的優(yōu)化研究更有重大的實際意義，可以使其在工業(yè)水處理中有著更廣闊的應(yīng)用前景。

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