閬中市副豬嗜血桿菌病的分子流行病學(xué)調(diào)查及主要血清型確定

李建華，沈峻宇 ，楊 嵩，陳定超

（1.四川省閬中市畜牧局，四川 閬中 637400；2.四川省南充市順慶區(qū)畜牧局，四川 南充 637000；3.四川省畜牧總站，四川 成都 610041）

副豬嗜血桿菌（HPS）起初被稱為豬嗜血桿菌或豬流感嗜血桿菌，是豬上呼吸道的一種常在菌[1]。該菌常與其他呼吸道病原混合或繼發(fā)感染[2-4]，主要的攻擊對象是仔豬和青年豬。本試驗(yàn)對閬中市16個規(guī)模化豬場進(jìn)行了HPS流行病學(xué)調(diào)查，為當(dāng)?shù)赜行Х揽卦摬√峁┮罁?jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料來源及實(shí)驗(yàn)動物 病料來源于閬中市的16個規(guī)?；B(yǎng)豬場，采集自疑似患副豬嗜血桿菌病的豬的肺臟、鼻拭子、氣管黏液、淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、關(guān)節(jié)液和心包滲出液等。

副豬嗜血桿菌的陽性病料由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存并提供。試驗(yàn)中用于制備各個分型血清的健康家兔（體重3～4kg/只），購自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場。

1.2 所需分子生物學(xué)試劑 蛋白酶K、SDS、Ttis飽和酚，2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker DL2000、pMD19-T Vector，瓊脂糖，NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），Column DNABACK柱式DNABACK，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，其他試劑如無水乙醇、氯仿等均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50FB，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9146A，高速冷凍離心機(jī)Sigma 3-18K，恒溫水浴鍋，微量加樣器，PCR儀Mycycler，核酸電泳系統(tǒng)DYY-2C，穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀DYY-III-8B，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)，渦旋混合振蕩器，水浴鍋。

1.4 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)液、LA培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)液和氨芐平板，其制備均按照說明書進(jìn)行。

1.5 引物的設(shè)計與合成 從Genbank上下載已經(jīng)公布的HPS 16S rRNA核苷酸序列，根據(jù)HPS 16S rRNA序列設(shè)計引物，引物由大連寶生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

表1 HPS引物設(shè)計

按使用說明將引物稀釋為10pmol/μL，放-20℃冰箱中備用。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 用無菌接種環(huán)蘸取肺臟組織、氣管黏液、心包滲出液和關(guān)節(jié)液接種在含0.05%NAD的TSA 培養(yǎng)基上，置37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h，觀察細(xì)菌菌落，再進(jìn)行細(xì)菌純培養(yǎng)。

2.2 HPS的PCR鑒定 PCR鑒定按Oliveira等建立的HPS PCR鑒定方法進(jìn)行HPS 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為821 bp。細(xì)菌基因組DNA的抽提按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行。采用PCR技術(shù)對提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時做陰性對照和陽性對照。反應(yīng)體系（20μL）為：2×Taq PCR MasterMix 10μL，雙蒸水 5μL，上游引物和下游引物各1μL，DNA模板3μL。

取8μL PCR產(chǎn)物加入1%瓊脂糖凝膠板加樣孔中，同時取8μL DNA Marker DL2000作為參照物，在120V電壓下電泳20min，結(jié)束后將1%瓊脂糖凝膠放于紫外凝膠成像儀中觀察并保存圖像。

2.3 HPS 16S rRNA克隆與序列分析 若2.3中出現(xiàn)正確的目的條帶（821bp），則進(jìn)行基因克隆與序列分析。

2.3.1 凝膠塊中DNA的膠回收、純化 膠回收按照下列步驟進(jìn)行：在膠回收離心管中按重量比1∶3～1∶5加入通用溶膠液（即：100mg的瓊脂糖凝膠需要加入300～500μL通用溶膠液），放50℃水浴鍋中使膠完全溶化；將離心管中的溶液轉(zhuǎn)到離心吸附柱中，套上收集管，靜置3min，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的液體，加入0.7～0.8mL的通用洗柱液，室溫靜置2min，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的液體，再以12000r/min離心30s，以除去離心柱中的殘留液體；將離心柱放于一支新的干凈的離心管中，加入30～100 μL 50～65℃的 DNA 洗脫液，靜置 3 min，12 000r/min離心1min，離心管里所得的溶液即為膠回收產(chǎn)物。放于-20℃冰箱中備用。

2.3.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備 將大腸桿菌DH5α貯存液在無菌LA平板上劃線，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落接種到一只裝有5mL LB培養(yǎng)液的滅菌試管中，37℃ 200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，按照1%（V/V）比例接入新鮮LB培養(yǎng)液，取2mL接種于100mL LB培養(yǎng)液中，37℃ 200r/min振蕩培養(yǎng)2～2.5h，測得OD值為0.5左右（此時細(xì)菌處于對數(shù)生長期）。將菌液加入到無菌EP管中，冰上放置10min后，4℃ 5000r/min離心10min，棄上清，將菌體懸浮于10mL的無菌、預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液中，4℃ 3000r/min離心10min，棄上清，再將菌體懸浮于2mL的無菌、預(yù)冷的已經(jīng)加入甘油的0.1mol/L CaCl2溶液中（甘油按照15%比例加入），分裝到無菌1.5mL EP管中，放4℃冰箱過夜后，置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 連接 將膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，反應(yīng)體系（10μL）為：Solution I 5μL，pMD19-T 1μL，膠回收產(chǎn)物4μL。16℃連接過夜。

2.3.4 轉(zhuǎn)化 在無菌條件下，將新鮮制備或者在-70℃保存?zhèn)溆玫腄H5α感受態(tài)細(xì)胞在冰上溶解后輕輕混勻。取10μL連接產(chǎn)物，無菌加入已經(jīng)均勻懸浮的100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，溫和搖勻，冰浴30min，42℃水浴，熱激90s。冰浴3～5min（使感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，讓質(zhì)粒充分進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)），加入37℃的900μL LB培養(yǎng)液（無Amp），在37℃水浴鍋內(nèi)250r/min溫和振蕩1h，使細(xì)菌恢復(fù)耐藥性。室溫下，3000r/min離心5min，棄去700μL上清液，用剩余的培養(yǎng)液將細(xì)菌沉淀懸浮，均勻涂布于氨芐平板上，在37℃培養(yǎng)箱中正向放置30min吸取掉多余液體后，倒置，培養(yǎng)10～16h。無菌挑取單個菌落接種于3～4mL含Amp溶液的LB培養(yǎng)液中，37℃ 250r/min振蕩培養(yǎng) 6～8h。然后按 7∶3（菌液∶甘油）分裝至無菌EP管中，其中一管用于測序，其余放-70℃冰箱內(nèi)保存。

2.3.5 序列比較 從NCBI上下載已經(jīng)公布的HPS 16S rRNA 序列（登錄號：AB004039.1、AB004037.1、AB004036.1、AB004035.1、AB004034.1），將這些基因的相應(yīng)區(qū)域與測序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行比對，查看其同源性。

2.4 血清型的確定 本試驗(yàn)用蘭州獸醫(yī)研究所饋贈的血清型1～15標(biāo)準(zhǔn)株來制備副豬嗜血桿菌分型血清，并根據(jù)玻板凝集試驗(yàn)[5]確定HPS的血清型。

2.4.1 分型血清的制備 分別用血清型1～15標(biāo)準(zhǔn)株劃線接種于TSA平板上，37℃培養(yǎng)24～48h，挑取單個菌落，接種于含4～5mL TSB培養(yǎng)液的試管中，37℃ 250r/min振蕩培養(yǎng)6～8h后涂布于TSA平板，放37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，然后用含0.2%福爾馬林的PBS（pH=7.2）沖洗下來，37℃過夜滅活，4℃4000r/min離心10 min，洗滌兩次，調(diào)整菌液濃度，使得OD600約等于1。然后均分成兩份，其中一份與等量的弗氏完全佐劑制成弗氏完全佐劑疫苗，另一份與等量弗式不完全佐劑制成弗式不完全佐劑疫苗。

每株標(biāo)準(zhǔn)株都按以下程序免疫健康家兔2只：用1.5mL弗氏完全佐劑疫苗于背部多點(diǎn)注射（第一次免疫），14d后再用1.5mL弗氏完全佐劑疫苗于背部多點(diǎn)注射（第二次免疫），11d后用3mL弗式不完全佐劑疫苗于背部多點(diǎn)注射（第三次免疫）；11d后用0.5mL病菌新鮮培養(yǎng)物（OD600值≈1）對每只家兔進(jìn)行耳靜脈注射攻毒，7～14d后采血，無菌分離血清，做玻板凝集試驗(yàn)測血清抗體，若出現(xiàn)明顯肉眼可見的凝集物就放血收集血清，若沒有凝集物出現(xiàn)，就繼續(xù)用0.5mL病菌新鮮培養(yǎng)物攻毒，7～14 d后再采血檢測，仍然不合格就重新免疫。以健康家兔的血清作陰性對照。所有血清于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 血清學(xué)分型 用PBS沖洗下TSA平板上生長的各分離株菌苔作為待檢菌液，將0.3mL待檢菌液與0.3mL分型血清混勻，同時用健康家兔血清作陰性對照。數(shù)分鐘后，若混合液仍均一渾濁，則為陰性反應(yīng)；若出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，則為陽性反應(yīng)，表示分離株與產(chǎn)生凝集物的標(biāo)準(zhǔn)株的血清型相同。

3 結(jié)果

3.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果 196份疑似HPS病料主要采集自21～60日齡的斷奶仔豬和保育豬，疑似病例全年都有發(fā)生，但在4～9月份相對集中。在所調(diào)查的196份病料中，共分離出了11株HPS，分離率只有5.61%，其中有9株是4～9月采集病料時分離出的，表明該病在4～9月發(fā)生明顯；分離出的HPS病料主要來自斷奶仔豬和保育豬，分離部位主要在肺臟和支氣管，肺臟、支氣管和關(guān)節(jié)液的分離率分別為54.5%（6/11）、36.4%（4/11）和 9.1%（1/11），說明肺臟和氣管是HPS存在的主要器官。

3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 培養(yǎng)基上的細(xì)菌菌落光滑濕潤，呈針尖大小、無色透明的露珠狀，約0.5 mm左右。取純培養(yǎng)36h的菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢，結(jié)果為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。

3.3 HPS的PCR鑒定 使用HPS 16S rRNA基因擴(kuò)增引物對分離的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，結(jié)果從分離的細(xì)菌基因組DNA中均擴(kuò)增出821 bp的目的片段。

3.4 HPS 16S rRNA序列分析 結(jié)果見表2。根據(jù)HPS 16S rRNA序列設(shè)計引物，經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增后，電泳發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物條帶大小為821bp，與預(yù)期相符。將分離到的11株HPS的PCR產(chǎn)物送到華大基因公司測序，將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其同源性為96.2%～99.76%，說明檢測出的確實(shí)是副豬嗜血桿菌陽性病料，而且HPS 16S rRNA序列保守性較高，不會因?yàn)榈赜虿煌l(fā)生很大的變異。

表2 同源性比對結(jié)果

3.5 HPS分離株的血清型鑒定結(jié)果 將分離到的11株HPS的菌液0.3mL與各分型血清0.3mL混合均勻，通過玻板凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清型分型，同時用健康家兔血清作陰性對照，結(jié)果顯示有8株能夠準(zhǔn)確分型，有2株出現(xiàn)交叉反應(yīng)，難以判斷，有1株不能與這15種分型血清發(fā)生陽性反應(yīng)，不能分型。在能分型的菌株當(dāng)中，血清型依次是5型4株、4型3株、12型1株。各分離株的血清型及其分布地區(qū)見表3。

表3 各分離株的血清型及其分布地區(qū)

4 討論與小結(jié)

本試驗(yàn)從196份疑似病料中檢出了11份陽性病料，陽性檢出率較低（為5.61%），可能是臨診時把副豬嗜血桿菌病與支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病等病混淆，致使所采集的病料不完全是副豬嗜血桿菌病陽性病料。從采集時間推斷該病在春、冬季的發(fā)病率低于夏、秋季。該試驗(yàn)還成功地克隆了這11株HPS的16S rRNA，將這些序列與NCBI上已公布的HPS序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其同源性在96.2%～99.76%之間，具有較高的保守性。

目前副豬嗜血桿菌的分型方法主要有血清學(xué)分型、基因分型、多態(tài)性圖譜分型。副豬嗜血桿菌血清型眾多，制備血清型1～15的各個分型血清是一件很困難且耗時耗力的工作。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同血清型的菌株刺激動物機(jī)體產(chǎn)生抗體的水平有很大差異，其中血清型 15、14、13、12、11、9、6、5、3 的菌株在第一次攻毒后就可與相應(yīng)的熱穩(wěn)定性抗原發(fā)生明顯的陽性反應(yīng)，而血清型10、8的菌株需要連續(xù)攻毒3次才能獲得比較滿意的結(jié)果。

有研究報道，采用瓊脂擴(kuò)散方法對HPS進(jìn)行血清型分型時，抗原制備的方法對HPS血清學(xué)分型的效果有較大影響[6-7]。本試驗(yàn)用玻板凝集試驗(yàn)對分離株進(jìn)行血清分型，避免了瓊脂擴(kuò)散方法中抗原制備不當(dāng)而對試驗(yàn)結(jié)果造成影響。

近年來，副豬嗜血桿菌的耐藥性越來越明顯，國家對抗生素在動物飼料中的應(yīng)用限制得比較嚴(yán)格，所以疫苗會逐步取代抗生素，成為預(yù)防、控制本病的主要措施[8]。但在實(shí)際生產(chǎn)中，有的疫苗免疫效果并不明顯，這可能與血清型有關(guān)；也可能是因?yàn)榕R床上用的大都是滅活苗，而滅活苗的交叉保護(hù)性低、免疫原性差，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)；還有可能與豬群的健康狀況有關(guān)。

不同血清型的副豬嗜血桿菌的毒力和致病力存在差異，毒力和免疫保護(hù)作用呈正相關(guān)。母安雄等[9]研究報道：血清型 5、1、10、13、12、14 為高毒力菌株，血清型 4、2、15 為中等毒力菌株，血清型 6、3、7、8、11為無毒力菌株。本次在閬中市分離出的HPS的血清型主要是5型、4型和12型，這些血清型的菌株基本上都是高毒力菌株。在制備針對閬中市HPS的有效疫苗時，可以將高毒力的血清型5、4、12菌株通過誘導(dǎo)發(fā)生突變，再選出毒力減弱的菌株制備成弱毒疫苗，這樣應(yīng)該有明顯的免疫效果且對仔豬的安全性較高。

[1]賀英，趙萍，儲岳峰，等.福建省部分地區(qū)副豬嗜血桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（2）:130-131.

[2]Oliveira S，Pijoan C.Computer-based analysis of Haemophilus parasuis protein fingerprints[J].Canadian Journal of Veterinary Research，2004，68（1）:71.

[3]Biberstein E L，White D C.A proposal for the establishmentoftwo new Haemophilusspecies[J].Journal of Medical Microbiology，1969，2（1）:75-78.

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[5]趙冉，陳瓊，蔡振鴻.副豬嗜血桿菌病的研究進(jìn)展[J].福建畜牧獸醫(yī)，2008，30（3）:20-23.

[6]陸國林，何海健.副豬嗜血桿菌病的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009（12）:162-165.

[7]涂玉蓉，李美娣，卓曲，等.副豬嗜血桿菌分型方法的研究進(jìn)展[J].福建畜牧獸醫(yī)，2012，34（5）:44-46.

[8]蘇丹萍，王文豪，章勝，等.副豬嗜血桿菌弱毒疫苗的研制[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（11）:169-173.

[9]母安雄，應(yīng)小飛，陶益，等.副豬嗜血桿菌的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2006，32（11）:48-50.