四種醫(yī)院制劑微生物限度檢查法驗(yàn)證試驗(yàn)

楊 靜 李曉翠 徐軼飛

北京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，北京 100071

四種醫(yī)院制劑均為含多種成分的復(fù)方制劑，處方組成比較復(fù)雜，其中呋柳擦劑與復(fù)方土荊皮酊處方中均含有水楊酸、苯甲酸成分，具有抗表皮真菌、止癢作用，用于手癬、腳癬、體癬等各種皮膚癬癥。由處方和功效可知，這兩種制劑具有一定的抑菌作用，含抑菌成分的醫(yī)院制劑的微生物限度檢查，必須先消除供試液的抑菌活性，然后再根據(jù)中國藥典規(guī)定的方法進(jìn)行檢查［1-3］。復(fù)方大承氣口服液是由大黃、芒硝、赤芍、桃仁、萊菔子、厚樸絲等藥材組成，具有化瘀行氣、通里攻下的作用，用于治療各型腸梗阻。防風(fēng)解毒口服液主要由白芷、防風(fēng)、荊芥、紫蘇葉、桂枝、桔梗等藥材經(jīng)加工而成，具有發(fā)散風(fēng)寒、辛溫解表的作用。醫(yī)院制劑沒有規(guī)定具體的微生物限度檢查方法，根據(jù)國家藥典委員會(huì)的要求，按照《中國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查法，分別對四種醫(yī)院制劑進(jìn)行了方法的驗(yàn)證，為規(guī)范醫(yī)院制劑的微生物限度檢查方法，提供了科學(xué)的依據(jù)。通過驗(yàn)證，復(fù)方大承氣口服液、防風(fēng)解毒口服液可用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查。呋柳擦劑與復(fù)方土荊皮酊細(xì)菌計(jì)數(shù)采用薄膜過濾法檢查，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)采用常規(guī)法檢查。

1 資料與方法

1.1 儀器

HTY-2000集菌儀（杭州泰林醫(yī)療器械廠）；GH-6000隔水式培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；LRH-250-MS霉菌培養(yǎng)箱（韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械有限公司）；DF3-3紅外線高溫干燥箱（北京興爭儀器設(shè)備廠）；LDZX立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 菌種

大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、金黃色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）［CMCC（B）26003］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］均購于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 培養(yǎng)基及試藥

營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂、營養(yǎng)肉湯、改良馬丁、改良馬丁瓊脂、膽鹽乳糖、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)分別為131218、1312192、131016、1309122、120113、140110、140124）均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.4 樣品

呋柳擦劑（北京軍區(qū)北戴河療養(yǎng)院，批號(hào)：20120917）、復(fù)方大承氣口服液（解放軍第261醫(yī)院，批號(hào)：121022）、復(fù)方土荊皮酊（解放軍白求恩國際和平醫(yī)院，批號(hào)：20120524）、防風(fēng)解毒口服液（解放軍第261醫(yī)院，批號(hào)：121105）。

2 方法

按照《中國藥典》2010年版一部［4］附錄XⅢ C微生物限度檢查法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.1 菌液的制備

（1）取經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1mL，用0.9％無菌氯化鈉溶液10倍稀釋制成每1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。

（2）取經(jīng)25～28℃培養(yǎng)18～24h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養(yǎng)物1mL，用0.9％無菌氯化鈉溶液10倍稀釋制成每1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。

（3）取經(jīng)25～28℃培養(yǎng)5～7d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加入3～5mL 0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液，用0.9％無菌氯化鈉溶液10倍稀釋制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。

2.2 供試液的制備

分別取供試品lOmL，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，制成1∶10的供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母茵計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

試驗(yàn)組（1）常規(guī)法：取1∶10的供試液1mL和50～100cfu試驗(yàn)菌，注入平皿中，每皿加15～20mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻、培養(yǎng)、觀察結(jié)果。各試驗(yàn)菌株的回收率結(jié)果，見表l。（2）培養(yǎng)基稀釋法：分別取1∶10的供試液0.5、0.2mL和50～100cfu試驗(yàn)菌，注入平皿中，每皿加15～20mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻、培養(yǎng)、觀察結(jié)果。（3）薄膜過濾法：取1∶10的供試液10mL加入薄膜過濾器中，全量通過薄膜后，再用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，沖洗量為100mL/膜，在沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，濾干，將濾膜貼至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)觀察結(jié)果。菌液組：除不加供試液外，其余操作同試驗(yàn)組。供試品對照組：除不加試驗(yàn)菌外，其余操作同試驗(yàn)組。

稀釋劑對照組∶用稀釋液代替供試液，其余操作同試驗(yàn)組。

3 結(jié)果

3.1 常規(guī)法

從表1的回收率試驗(yàn)結(jié)果可以看出：采用常規(guī)法，復(fù)方大承氣口服液和防風(fēng)解毒口服液對5種試驗(yàn)菌株的回收率均＞70％，無明顯抗菌活性，細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)均可用常規(guī)法檢查；復(fù)方土荊皮酊對金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和白色念珠菌的回收率均＜70％，有明顯的抑菌作用；呋柳擦劑對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的回收率均＜70％，對枯草芽胞桿菌的回收率為0，說明有顯著的抑菌作用。結(jié)果見表1。

表1 常規(guī)法的回收率試驗(yàn)結(jié)果（％）

表2 培養(yǎng)基稀釋法的回收率試驗(yàn)結(jié)果（％）

3.2 培養(yǎng)基稀釋法

從表2的回收率試驗(yàn)結(jié)果可以看出：采用培養(yǎng)基稀釋法后，復(fù)方土荊皮酊對對枯草芽胞桿菌的回收率＜70％；呋柳擦劑對金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的回收率均＜70％，因此，采用培養(yǎng)基稀釋法，復(fù)方土荊皮酊和呋柳擦劑仍有較強(qiáng)的抑菌活性。見表2。

3.3 薄膜過濾法

從表3的回收率試驗(yàn)結(jié)果可以看出：采用薄膜過濾法后，復(fù)方土荊皮酊和呋柳擦劑對金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的回收率均＞70％，消除了抑菌活性，細(xì)菌計(jì)數(shù)均可用薄膜過濾法，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)采用常規(guī)法檢查。見表3。

表3 薄膜過濾法的回收率試驗(yàn)結(jié)果（％）

4 討論

醫(yī)院制劑療效確切，價(jià)格低廉，深受群眾歡迎，因此，質(zhì)量控制尤其是微生物限度檢查顯得尤為重要［5-8］，只有建立科學(xué)的檢查方法，完善、提高醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)體系，才能有效提高醫(yī)院制劑的監(jiān)管水平。

呋柳擦劑和復(fù)方土荊皮酊的處方中均含有水楊酸和苯甲酸，這兩種成分對微生物的生長有一定的抑制性，藥品中污染的微生物在這些成分的影響下有可能檢不出，但是當(dāng)抑菌成分消除后或濃度降低時(shí)，這些微生物便可復(fù)蘇并繁殖，如果按照常規(guī)法進(jìn)行檢查，可能會(huì)造成檢驗(yàn)結(jié)果的漏檢或者誤判［9-16］。因此分別采用培養(yǎng)基稀釋法、常規(guī)法和薄膜過濾法逐一進(jìn)行了驗(yàn)證，來降低或消除抑菌成分對試驗(yàn)的干擾，以證明所采用的方法適合于該藥物微生物限度檢查。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在制備呋柳擦劑和復(fù)方土荊皮酊的供試液時(shí)，由于處方中均含有水楊酸和苯甲酸，加入稀釋液后易產(chǎn)生絮狀沉淀，因此應(yīng)充分搖勻保證試驗(yàn)的平行性和有效性。在稀釋菌液時(shí)采用了旋渦混懸器進(jìn)行混勻，這種方法本研究在以往的文獻(xiàn)中尚未查到，是在反復(fù)的試驗(yàn)、思考中摸索而來，此法耗時(shí)短，方法簡單，不需用吸管反復(fù)吹打，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度，提高了工作效率。

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