• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    菩人丹超微粉對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞間黏附分子-1表達的影響

    2015-12-30 06:29:15崔秀成,董志軍
    中國老年學雜志 2015年3期
    關鍵詞:超微粉條帶視網(wǎng)膜

    菩人丹超微粉對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞間黏附分子-1表達的影響

    崔秀成董志軍

    (承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科,河北承德067000)

    摘要〔〕目的探討探討菩人丹超微粉(PRD)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞間黏附分子(ICAM-1)表達的影響。方法36只Wistar大鼠隨機分為3組,正常對照組、糖尿病模型組和PRD治療組,每組12只。糖尿病模型組和PRD治療組大鼠均采用鏈脲佐菌素連續(xù)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型。模型成功建立后,PRD治療組大鼠給予PRD灌胃,時間為3個月。采用SP免疫組織化學染色法、Western印跡法檢測視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白的表達;逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測視網(wǎng)膜ICAM-1 mRNA的表達。結果糖尿病模型組與正常對照組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白及mRNA表達均明顯升高(P<0.01),PRD治療組與糖尿病模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白及mRNA表達均明顯降低(P<0.01)。結論PRD可通過下調ICAM-1的表達,抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應,發(fā)揮對糖尿病視網(wǎng)膜損傷的保護作用。

    關鍵詞〔〕菩人丹超微粉;糖尿病視網(wǎng)膜病變;細胞間黏附分子-1

    中圖分類號〔〕R774.1〔

    基金項目:河北省中醫(yī)藥管理局資助項目(2014066)

    通訊作者:董志軍(1978-),男,碩士,副主任醫(yī)師,主要從事糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究。

    第一作者:崔秀成(1964-),男,副主任醫(yī)師,主要從事糖尿病眼病研究。

    糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥,是導致不可逆性盲的重要原因之一〔1,2〕。研究表明〔3〕,細胞間黏附分子(ICAM)-1介導的炎癥反應在DR的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,抑制眼內ICAM-1失衡是DR防治的重要靶方向。菩人丹超微粉(PRD)針對糖尿病病機關鍵“熱、虛、瘀”,依據(jù)傳統(tǒng)方,并結合臨床研究及現(xiàn)代藥理學研究成果,確立以苦瓜為君藥,人參、丹參為臣藥,葛根、何首烏、水蛭為佐使藥的菩人丹中藥組方。諸藥協(xié)同,益氣養(yǎng)陰,調暢氣血,化瘀通絡?,F(xiàn)代藥理研究證實PRD具有抑制氧化應激、對抗細胞凋亡和衰老、改善微循環(huán)、促進組織修復與再生等作用〔4〕。前期研究證實:PRD能有效修復2型糖尿病大鼠損傷的胰島β細胞、降低血糖,并具有保護糖尿病并發(fā)的大血管、微血管病變等作用〔4,5〕。本文旨在通過觀察PRD對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1表達的影響,探討PRD對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜炎癥病變的保護作用。

    1材料與方法

    1.1藥物與試劑PRD由苦瓜、人參、丹參、制首烏、葛根、水蛭按10∶1∶3∶1∶1∶0.3的比例組方提取而成,每1 g超微粉相當于8~15 g生藥,由中央民族大學中國少數(shù)民族醫(yī)學研究院提供;鏈脲佐菌素(STZ),美國Sigma公司;Trizol,美國Invitrogen公司;ICAM-1兔抗多克隆抗體,武漢博士德生物工程公司;ICAM-1引物,上海生工公司;SP免疫組化試劑盒,北京中杉金橋生物技術公司;蛋白定量試劑盒,北京索萊寶生物科技有限公司;RT-PCR試劑盒,大連寶生物工程有限公司。

    1.2實驗動物清潔級雄性Wistar大鼠〔北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證編號:SCXK(京)2006~0009〕,體質量200~250 g。動物的飼養(yǎng)和實驗過程遵循中國科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

    1.3動物模型制備及分組將36只大鼠應用隨機數(shù)字表法進行完全隨機化分組,分為正常對照組、糖尿病模型組和PRD治療組,每組12只。糖尿病模型組、PRD治療組大鼠均采用質量分數(shù)2% STZ(25 mg·kg-1·d-1)腹腔注射建立糖尿病動物模型,每日注射1次,連續(xù)3 d,以血糖≥16.7 mmol/L作為成模標準〔6〕。模型成功建立后,模型組大鼠不做任何處理;按體表面積折算確定PRD治療組大鼠給藥劑量為每日1.8 g/kg,連續(xù)灌胃3個月。

    1.4標本制備給藥結束后,10%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 g/kg)大鼠,迅速取出雙側眼球。一側眼球浸于4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,備用于免疫組織化學染色;另一側眼球迅速在動物手術顯微鏡下冰面上鈍性分E離視網(wǎng)膜,投入液氮中保存,分別備用于Western印跡及RT-PCR檢測。

    1.5免疫組織化學染色檢測ICAM-1蛋白的表達眼球平行視神經(jīng)連續(xù)矢狀切片,片厚4 μm,采用SP免疫組織化學染色法檢測視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達。 一抗稀釋濃度均為1∶100,DAB顯色,蘇木素復染細胞核。以0.01 mmol/L PBS代替一抗作為陰性對照,以胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。

    1.6Western印跡檢測視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白的表達取液氮中保存的視網(wǎng)膜組織,提取蛋白質,以BCA蛋白試劑盒定量蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg,12% SDS-PAGE凝膠電泳,80~120 V、2 h,電泳完畢后轉移至硝酸纖維素膜;5% 脫脂奶粉TBST封閉2 h;加入1∶200稀釋的ICAM-1抗體,4℃過夜;洗膜后用1∶5 000稀釋的二抗辣根過氧化物酶(HRP)交聯(lián)物室溫搖床孵育1 h;Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。采用Quantity One-4.6.2軟件對顯影條帶進行分析,以ICAM-1條帶與β-actin條帶的灰度比值作為目的蛋白的相對表達水平。

    1.7RT-PCR法檢測視網(wǎng)膜ICAM-1 nRNA表達視網(wǎng)膜組織,在液氮中碾磨成粉末,按Trizol總RNA抽提說明書操作,提取視網(wǎng)膜組織的總RNA。取5 μl RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳,可見明顯的28 s、18 s和5 s三條完整的條帶,說明抽提的總RNA比較完整;紫外分光光度計檢測OD260/OD280值為1.9~2.1,說明RNA沒有被污染。取3 μg總RNA為模板逆轉錄成cDNA,反應條件為:30℃,10 min;55℃,30 min;99℃,5 min;5℃,5min。PCR反應條件:94℃,2 min;94℃,30 s;50℃~65℃,30 s;72℃,1 min,第二步起循環(huán)。ICAM-1引物序列為:正義鏈:5’ ACCCACCTCACAGGGTACTTC 3’,反義鏈:5’ GAGTCTGCTGAGACCCCTCTT 3’,退火溫度為60℃,29個循環(huán),產物大小為233 bp;β-actin引物序列為:正義鏈::5’CATCCTGCGTCTGGACCT 3’,反義鏈:5’TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3’,退火溫度為58℃,29個循環(huán),產物大小為480 bp。PCR產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像,并用Quantity One-4.6.2軟件進行定量分析,以目的條帶的光密度與β-actin條帶光密度的比值,作為ICAM-1 mRNA表達的相對水平。

    1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

    2結果

    2.1免疫組織化學檢測結果ICAM-1免疫陽性產物位于胞質,呈棕黃色顆粒狀,免疫陽性細胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內核層。糖尿病模型組ICAM-1陽性產物表達明顯強于正常組,胞漿呈深棕黃色;PRD治療后,ICAM-1陽性產物表達較模型組減弱,胞質呈棕黃色。

    2.2Western印跡法檢測結果在蛋白Marker的97 kD、43 kD水平處,分別可見ICAM-1的蛋白條帶及β-actin條帶。糖尿病模型組與正常對照組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達明顯升高(P<0.01);PRD治療組與糖尿病模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達明顯降低(P<0.01)。見表1。

    2.3RT-PCR檢測結果在DNA Marker的233 bp、480 bp水平處分別可見清晰的ICAM-1及β-actin mRNA條帶。糖尿病模型組與正常對照組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1 mRNA表達明顯升高(P<0.01);PRD治療組與糖尿病模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1 mRNA表達明顯降低(P<0.01)。見表1。

    表1 各組大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白及

    與糖尿病模型組比較:1)P<0.01

    3討論

    視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)的損害是DR的重要特征,血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)功能障礙和視網(wǎng)膜新生血管形成是DR的主要病理改變,是導致DR患者視力損害的主要血管性因素〔7〕。近年的觀點認為DR是一種由代謝紊亂引起的炎癥性疾病,炎癥因子過度表達介導的炎癥反應在糖尿病視網(wǎng)膜微血管損傷中起到了關鍵作用,特別是ICAM-1被認為是與DR聯(lián)系緊密的炎癥因子〔8〕。

    ICAM-1是一種對免疫反應、炎癥反應有重要調節(jié)和介導作用的炎癥因子〔9〕。正常生理情況下,低濃度的ICAM-1及其配體在維持正常組織結構,參與細胞凋亡、增殖過程中起重要作用。Zhu等〔10〕研究表明,在STZ致糖尿病大鼠模型的視網(wǎng)膜組織中的ICAM-1表達異常升高,應用ICAM-1抑制劑后可以改善高血糖時視網(wǎng)膜炎性病變,提示ICAM-1在DR微血管病變過程中發(fā)揮重要作用。

    本研究發(fā)現(xiàn),糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白和mRNA的表達均明顯增高。糖尿病時慢性高血糖可引起代謝發(fā)生異常,導致視網(wǎng)膜毛細血管結構和功能破壞,引起視網(wǎng)膜血流動力學改變,視網(wǎng)膜處于缺血、缺氧狀態(tài),細胞內活性氧產生,導致視網(wǎng)膜氧化應激、局部炎癥反應增強,進而誘導強有力的炎癥分子ICAM-1表達異常升高,高表達的ICAM-1使白細胞淤滯,白細胞黏附可引起視網(wǎng)膜毛細血管內皮細胞的凋亡,激活血小板,導致血流緩慢和血栓形成、毛細血管無灌注的形成及血視網(wǎng)膜屏障破壞,從而促進DR的發(fā)生發(fā)展〔8〕。

    本研究表明PRD可通過下調視網(wǎng)膜組織ICAM-1的表達,減少視網(wǎng)膜微血管滲漏及病理性新生血管生成,發(fā)揮對糖尿病視網(wǎng)膜微血管損傷的保護作用。由于PRD可發(fā)揮中藥組方多環(huán)節(jié)、多靶位的治療優(yōu)勢,且對人體無毒性,避免了化學合成藥物帶給人體的不良反應,因此可能為DR治療提供新的方法。

    4參考文獻

    1Zhang W,Liu H,Al-Shabrawey M,etal.Inflammation and diabetic retinal microvascular complications〔J〕.J Cardiovasc Dis Res,2011;2(2):96-103.

    2Mahdy RA,Nada WM.Evaluation of the role of vascular endothelial growth factor in diabetic retinopathy〔J〕.Ophthalmic Res,2011;45(2):87-91.

    3Wu CF,Xue JR,Lang P.Effects of melatonin on oxidative stress and the expression of ICAM-1 on retina in diabetic rat〔J〕.Chin Ophthal Res,2010;28(4):330-3.

    4龐宗然,趙玉堂,李靜華,等.菩人丹超微粉對肥胖型2型糖尿病大鼠糖代謝相關指標的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2010;16 (5):107-10.

    5龐宗然,劉祖涵,蘇曉惠,等.菩人丹超微粉對肥胖型T2DM大血管損傷大鼠ET-1、NO、FFAs含量的影響〔J〕.中國老年學雜志,2011;31(10):1779-80.

    6向雪松,王竹祝,宇銘,等.鏈脲佐菌素注射劑量對建立2型糖尿病大鼠模型的影響〔J〕.衛(wèi)生研究,2010;39(2):138-42.

    7Pelzek C,Lim JI.Diabetic macular edema:review and update〔J〕.Ophthalmol Clin North Am,2002;15(4):555-63.

    8Zhang XL,Wen L,Chen YJ,etal.Vascular endothelial growth factor up-regulates the expression of intracellular adhesion molecule-1 in retinal endothelial cells via reactive oxygen species,but not nitric oxide〔J〕.Chin Med J(Engl),2009;122(3):338-43.

    9Kim YS,Park GB,Song HK,etal.Cross-linking of cd54 on Burkitt lymphoma cell line Raji and Ramos induces FasL expression by reactive oxygen species and apoptosis of adjacent cells in Fas/FasL interaction〔J〕.Immunotberapy,2007;30(7):727-39.

    10Zhu Y,Zhang XL,Zhu BF,etal.Effect of antioxidant N-acetylcysteine on diabetic retinopathy and expression of VEGF and ICAM-1 from retinal blood vessels of diabetic rats〔J〕.Mol Biol Rep,2011;28(9):〔Epub ahead of print〕.

    〔2013-08-12修回〕

    (編輯趙慧玲/曹夢園)

    猜你喜歡
    超微粉條帶視網(wǎng)膜
    深度學習在糖尿病視網(wǎng)膜病變診療中的應用
    復合雜糧超微粉微膠囊化工藝的研究
    家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變合并孔源性視網(wǎng)膜脫離1例
    高度近視視網(wǎng)膜微循環(huán)改變研究進展
    廣藿香超微粉表面包覆技術工藝的優(yōu)化
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:35
    浙貝母超微粉、粗粉和飲片中3 種生物堿體外溶出度的比較
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    復明片治療糖尿病視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜光凝術后臨床觀察
    蒙藏醫(yī)傳統(tǒng)藥浴超微粉中槲皮素的定性與定量研究
    基于條帶模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的雙基成像算法
    基于 Savitzky-Golay 加權擬合的紅外圖像非均勻性條帶校正方法
    中國光學(2015年1期)2015-06-06 18:30:20
    亚洲无线观看免费| 偷拍熟女少妇极品色| 中文字幕高清在线视频| 精品久久久久久久末码| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲欧美日韩高清专用| 床上黄色一级片| 久久久久久久久大av| 国产午夜福利久久久久久| 国产在线精品亚洲第一网站| 99在线视频只有这里精品首页| 色播亚洲综合网| 男女床上黄色一级片免费看| 国产午夜福利久久久久久| 天堂网av新在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产乱人伦免费视频| 亚洲欧美清纯卡通| eeuss影院久久| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久精品欧美日韩精品| 全区人妻精品视频| 五月伊人婷婷丁香| 男女那种视频在线观看| 一本久久中文字幕| 无遮挡黄片免费观看| 欧美日本视频| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 舔av片在线| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 丰满乱子伦码专区| 一区二区三区高清视频在线| 波多野结衣高清无吗| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久午夜亚洲精品久久| 黄色视频,在线免费观看| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 极品教师在线免费播放| 丝袜美腿在线中文| 色精品久久人妻99蜜桃| 我要搜黄色片| 久久亚洲真实| 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 成人av在线播放网站| 午夜精品在线福利| 国产美女午夜福利| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成人欧美在线观看| 极品教师在线视频| bbb黄色大片| x7x7x7水蜜桃| 日韩亚洲欧美综合| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 露出奶头的视频| av在线天堂中文字幕| 日日干狠狠操夜夜爽| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 午夜影院日韩av| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲avbb在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 看十八女毛片水多多多| 久久国产精品影院| 亚洲乱码一区二区免费版| 午夜影院日韩av| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品一区二区三区四区久久| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 嫩草影院新地址| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 欧美黄色淫秽网站| 国产综合懂色| 国产精品久久电影中文字幕| 成人欧美大片| 赤兔流量卡办理| 一本综合久久免费| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美三级亚洲精品| 亚洲av成人精品一区久久| 极品教师在线视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久性视频一级片| 欧美精品国产亚洲| 日韩欧美精品v在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 最好的美女福利视频网| 日本与韩国留学比较| 国产真实伦视频高清在线观看 | 欧美日韩黄片免| 我的老师免费观看完整版| 一区二区三区高清视频在线| 国产爱豆传媒在线观看| 久久精品人妻少妇| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久久精品大字幕| 老女人水多毛片| 日韩国内少妇激情av| 久久精品91蜜桃| 97碰自拍视频| 久久国产乱子免费精品| 亚洲精品在线观看二区| 全区人妻精品视频| 精华霜和精华液先用哪个| 长腿黑丝高跟| 岛国在线免费视频观看| 99精品久久久久人妻精品| 久9热在线精品视频| 特大巨黑吊av在线直播| 国产欧美日韩精品一区二区| 赤兔流量卡办理| 亚洲欧美日韩东京热| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日本熟妇午夜| 亚洲欧美日韩东京热| 成人国产综合亚洲| 丁香六月欧美| 国产成人a区在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 我的女老师完整版在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va | 亚洲中文字幕日韩| 成人永久免费在线观看视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美国产日韩亚洲一区| 十八禁网站免费在线| 国产91精品成人一区二区三区| 国产高清视频在线播放一区| 伦理电影大哥的女人| 天美传媒精品一区二区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 一区二区三区激情视频| 国产探花在线观看一区二区| 欧美潮喷喷水| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产精品一区二区性色av| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产精品精品国产色婷婷| 午夜福利欧美成人| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 日本a在线网址| 亚洲精品一区av在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 国产色婷婷99| 在线观看av片永久免费下载| 成人特级av手机在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 色综合婷婷激情| 亚洲国产精品合色在线| 在线天堂最新版资源| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 黄色日韩在线| 日韩欧美精品v在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲片人在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久久国产成人免费| 久久久国产成人精品二区| 国产av一区在线观看免费| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲无线在线观看| 国产淫片久久久久久久久 | 国产精品亚洲美女久久久| 在线天堂最新版资源| 色在线成人网| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲欧美清纯卡通| 91在线观看av| 黄色女人牲交| 99热这里只有是精品在线观看 | 日韩高清综合在线| 久久久久久久久中文| 日韩成人在线观看一区二区三区| 最后的刺客免费高清国语| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品影院久久| 色播亚洲综合网| 免费在线观看亚洲国产| 免费黄网站久久成人精品 | 欧美极品一区二区三区四区| 99热精品在线国产| 在线观看舔阴道视频| 少妇高潮的动态图| 国产精品久久久久久久电影| 又粗又爽又猛毛片免费看| 宅男免费午夜| 免费观看人在逋| 国产真实乱freesex| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费| 免费看光身美女| 亚洲精品亚洲一区二区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲七黄色美女视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久九九热精品免费| 国产熟女xx| 草草在线视频免费看| 搡老妇女老女人老熟妇| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美日韩黄片免| 亚洲最大成人av| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲久久久久久中文字幕| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久久久久九九精品二区国产| 免费观看人在逋| 男女那种视频在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲成av人片免费观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品一及| 亚洲精品456在线播放app | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲内射少妇av| 久久草成人影院| 在线天堂最新版资源| 99国产综合亚洲精品| 国产精品永久免费网站| 国产精品影院久久| 最后的刺客免费高清国语| 在线观看舔阴道视频| 亚洲av.av天堂| 桃色一区二区三区在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| av视频在线观看入口| 免费在线观看日本一区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产精华一区二区三区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲av成人av| 99久国产av精品| 999久久久精品免费观看国产| 18禁在线播放成人免费| 怎么达到女性高潮| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲av成人av| 精品久久久久久久久久久久久| 一区二区三区高清视频在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲精华国产精华精| 一进一出抽搐动态| 成人午夜高清在线视频| 一个人免费在线观看电影| 一级黄片播放器| 国产色爽女视频免费观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 一二三四社区在线视频社区8| or卡值多少钱| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲av.av天堂| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 真人一进一出gif抽搐免费| 九色国产91popny在线| 久久国产精品影院| 久久这里只有精品中国| 亚洲av电影在线进入| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 一本精品99久久精品77| 免费看光身美女| 美女大奶头视频| 一级毛片久久久久久久久女| 国产成人aa在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日日干狠狠操夜夜爽| 高清在线国产一区| 亚洲第一区二区三区不卡| 90打野战视频偷拍视频| 国产视频内射| 国产精品亚洲一级av第二区| or卡值多少钱| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产午夜福利久久久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 天天一区二区日本电影三级| 88av欧美| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲在线自拍视频| 此物有八面人人有两片| 九九热线精品视视频播放| 最新在线观看一区二区三区| 一本综合久久免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 黄片小视频在线播放| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 乱码一卡2卡4卡精品| 黄色配什么色好看| 亚洲片人在线观看| 欧美乱妇无乱码| 午夜久久久久精精品| 久久精品综合一区二区三区| 成人av在线播放网站| 在线观看舔阴道视频| 亚洲av.av天堂| 毛片女人毛片| netflix在线观看网站| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲内射少妇av| 真人一进一出gif抽搐免费| 免费观看精品视频网站| 精品一区二区三区av网在线观看| 在线天堂最新版资源| 国产黄a三级三级三级人| 精品人妻熟女av久视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲av免费高清在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲最大成人av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产大屁股一区二区在线视频| 白带黄色成豆腐渣| avwww免费| 免费观看人在逋| 亚洲人成网站在线播| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲国产精品999在线| 一夜夜www| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲国产精品合色在线| 久久精品国产自在天天线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 一进一出抽搐动态| 亚洲在线自拍视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 毛片一级片免费看久久久久 | 90打野战视频偷拍视频| 国产成人aa在线观看| av在线老鸭窝| 日韩精品青青久久久久久| 色哟哟·www| 午夜精品在线福利| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久久色成人| 亚洲中文日韩欧美视频| 美女免费视频网站| 岛国在线免费视频观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 窝窝影院91人妻| 网址你懂的国产日韩在线| 精品久久久久久,| 国产三级黄色录像| 午夜激情欧美在线| 国产在线男女| 无遮挡黄片免费观看| 久久久久久大精品| 亚洲无线在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲av二区三区四区| 免费av毛片视频| 国产亚洲欧美98| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久久久大精品| 久久伊人香网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产伦人伦偷精品视频| 午夜福利成人在线免费观看| 在线天堂最新版资源| 婷婷色综合大香蕉| 欧美bdsm另类| 深爱激情五月婷婷| 国产中年淑女户外野战色| 国产色爽女视频免费观看| 日本黄大片高清| 午夜福利免费观看在线| 国产亚洲欧美98| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲自拍偷在线| 18禁在线播放成人免费| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品久久久久久精品电影| 三级毛片av免费| 精品福利观看| 精品久久久久久久久av| 中出人妻视频一区二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲熟妇熟女久久| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲内射少妇av| 校园春色视频在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 夜夜爽天天搞| 欧美乱色亚洲激情| 国产一区二区在线av高清观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品久久久久久久久免 | 午夜福利在线在线| 禁无遮挡网站| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美性猛交黑人性爽| 日韩欧美在线二视频| ponron亚洲| 久久6这里有精品| 国产精品不卡视频一区二区 | 精品一区二区三区av网在线观看| 久久这里只有精品中国| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美区成人在线视频| 天天躁日日操中文字幕| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品人妻视频免费看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 很黄的视频免费| 国产精品一区二区性色av| 俺也久久电影网| 欧美最新免费一区二区三区 | 精品久久久久久久末码| 在线观看舔阴道视频| 亚州av有码| 精品人妻熟女av久视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产av不卡久久| 天堂影院成人在线观看| av欧美777| 99热这里只有精品一区| 色在线成人网| 国内精品久久久久久久电影| 此物有八面人人有两片| 在现免费观看毛片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| a级毛片a级免费在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品,欧美在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久亚洲真实| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲美女搞黄在线观看 | 欧美最黄视频在线播放免费| 国产精品免费一区二区三区在线| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 神马国产精品三级电影在线观看| 级片在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美在线一区亚洲| 亚洲,欧美,日韩| 欧美一区二区国产精品久久精品| 如何舔出高潮| 成人欧美大片| 日韩欧美精品免费久久 | 亚洲国产欧美人成| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 成年免费大片在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 欧美极品一区二区三区四区| 可以在线观看的亚洲视频| 少妇高潮的动态图| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 99久久精品国产亚洲精品| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 99riav亚洲国产免费| 午夜久久久久精精品| 小说图片视频综合网站| 午夜福利免费观看在线| 亚洲av成人精品一区久久| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日本黄色片子视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品影院久久| 久久久久国内视频| 国产av麻豆久久久久久久| 久久久成人免费电影| 久久久国产成人精品二区| 12—13女人毛片做爰片一| 国产成人影院久久av| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国内精品久久久久久久电影| 在线观看66精品国产| а√天堂www在线а√下载| 在线国产一区二区在线| www.999成人在线观看| 亚洲avbb在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 精品久久久久久久末码| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品三级大全| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲色图av天堂| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品野战在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产中年淑女户外野战色| 1000部很黄的大片| 在现免费观看毛片| 欧美不卡视频在线免费观看| 一级毛片久久久久久久久女| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品国产三级普通话版| 国产成人aa在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 最近中文字幕高清免费大全6 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 在线观看免费视频日本深夜| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 88av欧美| 中出人妻视频一区二区| 亚洲精品亚洲一区二区| 男插女下体视频免费在线播放| 网址你懂的国产日韩在线| 一级毛片久久久久久久久女| 免费人成在线观看视频色| 亚洲自偷自拍三级| 国产综合懂色| 日本五十路高清| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品不卡国产一区二区三区| a级毛片a级免费在线| 老女人水多毛片| 久久人人精品亚洲av| 精品一区二区三区视频在线| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲国产欧美人成| 国产在线精品亚洲第一网站| www.色视频.com| 免费看日本二区| 91久久精品电影网| 18禁在线播放成人免费| 国产高清三级在线| 丁香欧美五月| 久久久色成人| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费搜索国产男女视频| 白带黄色成豆腐渣| 两个人视频免费观看高清| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 成人一区二区视频在线观看| 久久久久久久久大av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产精品一区二区性色av| 精品熟女少妇八av免费久了| 嫩草影视91久久| 久99久视频精品免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| 欧美色欧美亚洲另类二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 成年免费大片在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美在线黄色| 亚洲久久久久久中文字幕| avwww免费| 国产精品伦人一区二区| 日韩人妻高清精品专区| 可以在线观看的亚洲视频| 三级国产精品欧美在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品亚洲美女久久久| 精品久久国产蜜桃| 99热这里只有是精品50| 午夜a级毛片| 亚洲avbb在线观看| 国产高清激情床上av| 欧美高清性xxxxhd video| 在线观看一区二区三区| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲av成人精品一区久久| 国产高清有码在线观看视频| 两个人的视频大全免费| 精品日产1卡2卡| 少妇的逼好多水| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 免费在线观看成人毛片| 国产成年人精品一区二区| 99久久精品一区二区三区| 嫩草影院精品99| 国产 一区 欧美 日韩| 亚州av有码| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 人妻制服诱惑在线中文字幕|