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    菩人丹超微粉對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞間黏附分子-1表達的影響

    2015-12-30 06:29:15崔秀成,董志軍
    中國老年學雜志 2015年3期
    關鍵詞:超微粉條帶視網(wǎng)膜

    菩人丹超微粉對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞間黏附分子-1表達的影響

    崔秀成董志軍

    (承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科,河北承德067000)

    摘要〔〕目的探討探討菩人丹超微粉(PRD)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞間黏附分子(ICAM-1)表達的影響。方法36只Wistar大鼠隨機分為3組,正常對照組、糖尿病模型組和PRD治療組,每組12只。糖尿病模型組和PRD治療組大鼠均采用鏈脲佐菌素連續(xù)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型。模型成功建立后,PRD治療組大鼠給予PRD灌胃,時間為3個月。采用SP免疫組織化學染色法、Western印跡法檢測視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白的表達;逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測視網(wǎng)膜ICAM-1 mRNA的表達。結果糖尿病模型組與正常對照組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白及mRNA表達均明顯升高(P<0.01),PRD治療組與糖尿病模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白及mRNA表達均明顯降低(P<0.01)。結論PRD可通過下調ICAM-1的表達,抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應,發(fā)揮對糖尿病視網(wǎng)膜損傷的保護作用。

    關鍵詞〔〕菩人丹超微粉;糖尿病視網(wǎng)膜病變;細胞間黏附分子-1

    中圖分類號〔〕R774.1〔

    基金項目:河北省中醫(yī)藥管理局資助項目(2014066)

    通訊作者:董志軍(1978-),男,碩士,副主任醫(yī)師,主要從事糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究。

    第一作者:崔秀成(1964-),男,副主任醫(yī)師,主要從事糖尿病眼病研究。

    糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥,是導致不可逆性盲的重要原因之一〔1,2〕。研究表明〔3〕,細胞間黏附分子(ICAM)-1介導的炎癥反應在DR的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,抑制眼內ICAM-1失衡是DR防治的重要靶方向。菩人丹超微粉(PRD)針對糖尿病病機關鍵“熱、虛、瘀”,依據(jù)傳統(tǒng)方,并結合臨床研究及現(xiàn)代藥理學研究成果,確立以苦瓜為君藥,人參、丹參為臣藥,葛根、何首烏、水蛭為佐使藥的菩人丹中藥組方。諸藥協(xié)同,益氣養(yǎng)陰,調暢氣血,化瘀通絡?,F(xiàn)代藥理研究證實PRD具有抑制氧化應激、對抗細胞凋亡和衰老、改善微循環(huán)、促進組織修復與再生等作用〔4〕。前期研究證實:PRD能有效修復2型糖尿病大鼠損傷的胰島β細胞、降低血糖,并具有保護糖尿病并發(fā)的大血管、微血管病變等作用〔4,5〕。本文旨在通過觀察PRD對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1表達的影響,探討PRD對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜炎癥病變的保護作用。

    1材料與方法

    1.1藥物與試劑PRD由苦瓜、人參、丹參、制首烏、葛根、水蛭按10∶1∶3∶1∶1∶0.3的比例組方提取而成,每1 g超微粉相當于8~15 g生藥,由中央民族大學中國少數(shù)民族醫(yī)學研究院提供;鏈脲佐菌素(STZ),美國Sigma公司;Trizol,美國Invitrogen公司;ICAM-1兔抗多克隆抗體,武漢博士德生物工程公司;ICAM-1引物,上海生工公司;SP免疫組化試劑盒,北京中杉金橋生物技術公司;蛋白定量試劑盒,北京索萊寶生物科技有限公司;RT-PCR試劑盒,大連寶生物工程有限公司。

    1.2實驗動物清潔級雄性Wistar大鼠〔北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證編號:SCXK(京)2006~0009〕,體質量200~250 g。動物的飼養(yǎng)和實驗過程遵循中國科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

    1.3動物模型制備及分組將36只大鼠應用隨機數(shù)字表法進行完全隨機化分組,分為正常對照組、糖尿病模型組和PRD治療組,每組12只。糖尿病模型組、PRD治療組大鼠均采用質量分數(shù)2% STZ(25 mg·kg-1·d-1)腹腔注射建立糖尿病動物模型,每日注射1次,連續(xù)3 d,以血糖≥16.7 mmol/L作為成模標準〔6〕。模型成功建立后,模型組大鼠不做任何處理;按體表面積折算確定PRD治療組大鼠給藥劑量為每日1.8 g/kg,連續(xù)灌胃3個月。

    1.4標本制備給藥結束后,10%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 g/kg)大鼠,迅速取出雙側眼球。一側眼球浸于4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,備用于免疫組織化學染色;另一側眼球迅速在動物手術顯微鏡下冰面上鈍性分E離視網(wǎng)膜,投入液氮中保存,分別備用于Western印跡及RT-PCR檢測。

    1.5免疫組織化學染色檢測ICAM-1蛋白的表達眼球平行視神經(jīng)連續(xù)矢狀切片,片厚4 μm,采用SP免疫組織化學染色法檢測視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達。 一抗稀釋濃度均為1∶100,DAB顯色,蘇木素復染細胞核。以0.01 mmol/L PBS代替一抗作為陰性對照,以胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。

    1.6Western印跡檢測視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白的表達取液氮中保存的視網(wǎng)膜組織,提取蛋白質,以BCA蛋白試劑盒定量蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg,12% SDS-PAGE凝膠電泳,80~120 V、2 h,電泳完畢后轉移至硝酸纖維素膜;5% 脫脂奶粉TBST封閉2 h;加入1∶200稀釋的ICAM-1抗體,4℃過夜;洗膜后用1∶5 000稀釋的二抗辣根過氧化物酶(HRP)交聯(lián)物室溫搖床孵育1 h;Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。采用Quantity One-4.6.2軟件對顯影條帶進行分析,以ICAM-1條帶與β-actin條帶的灰度比值作為目的蛋白的相對表達水平。

    1.7RT-PCR法檢測視網(wǎng)膜ICAM-1 nRNA表達視網(wǎng)膜組織,在液氮中碾磨成粉末,按Trizol總RNA抽提說明書操作,提取視網(wǎng)膜組織的總RNA。取5 μl RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳,可見明顯的28 s、18 s和5 s三條完整的條帶,說明抽提的總RNA比較完整;紫外分光光度計檢測OD260/OD280值為1.9~2.1,說明RNA沒有被污染。取3 μg總RNA為模板逆轉錄成cDNA,反應條件為:30℃,10 min;55℃,30 min;99℃,5 min;5℃,5min。PCR反應條件:94℃,2 min;94℃,30 s;50℃~65℃,30 s;72℃,1 min,第二步起循環(huán)。ICAM-1引物序列為:正義鏈:5’ ACCCACCTCACAGGGTACTTC 3’,反義鏈:5’ GAGTCTGCTGAGACCCCTCTT 3’,退火溫度為60℃,29個循環(huán),產物大小為233 bp;β-actin引物序列為:正義鏈::5’CATCCTGCGTCTGGACCT 3’,反義鏈:5’TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3’,退火溫度為58℃,29個循環(huán),產物大小為480 bp。PCR產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像,并用Quantity One-4.6.2軟件進行定量分析,以目的條帶的光密度與β-actin條帶光密度的比值,作為ICAM-1 mRNA表達的相對水平。

    1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

    2結果

    2.1免疫組織化學檢測結果ICAM-1免疫陽性產物位于胞質,呈棕黃色顆粒狀,免疫陽性細胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內核層。糖尿病模型組ICAM-1陽性產物表達明顯強于正常組,胞漿呈深棕黃色;PRD治療后,ICAM-1陽性產物表達較模型組減弱,胞質呈棕黃色。

    2.2Western印跡法檢測結果在蛋白Marker的97 kD、43 kD水平處,分別可見ICAM-1的蛋白條帶及β-actin條帶。糖尿病模型組與正常對照組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達明顯升高(P<0.01);PRD治療組與糖尿病模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達明顯降低(P<0.01)。見表1。

    2.3RT-PCR檢測結果在DNA Marker的233 bp、480 bp水平處分別可見清晰的ICAM-1及β-actin mRNA條帶。糖尿病模型組與正常對照組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1 mRNA表達明顯升高(P<0.01);PRD治療組與糖尿病模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1 mRNA表達明顯降低(P<0.01)。見表1。

    表1 各組大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白及

    與糖尿病模型組比較:1)P<0.01

    3討論

    視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)的損害是DR的重要特征,血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)功能障礙和視網(wǎng)膜新生血管形成是DR的主要病理改變,是導致DR患者視力損害的主要血管性因素〔7〕。近年的觀點認為DR是一種由代謝紊亂引起的炎癥性疾病,炎癥因子過度表達介導的炎癥反應在糖尿病視網(wǎng)膜微血管損傷中起到了關鍵作用,特別是ICAM-1被認為是與DR聯(lián)系緊密的炎癥因子〔8〕。

    ICAM-1是一種對免疫反應、炎癥反應有重要調節(jié)和介導作用的炎癥因子〔9〕。正常生理情況下,低濃度的ICAM-1及其配體在維持正常組織結構,參與細胞凋亡、增殖過程中起重要作用。Zhu等〔10〕研究表明,在STZ致糖尿病大鼠模型的視網(wǎng)膜組織中的ICAM-1表達異常升高,應用ICAM-1抑制劑后可以改善高血糖時視網(wǎng)膜炎性病變,提示ICAM-1在DR微血管病變過程中發(fā)揮重要作用。

    本研究發(fā)現(xiàn),糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白和mRNA的表達均明顯增高。糖尿病時慢性高血糖可引起代謝發(fā)生異常,導致視網(wǎng)膜毛細血管結構和功能破壞,引起視網(wǎng)膜血流動力學改變,視網(wǎng)膜處于缺血、缺氧狀態(tài),細胞內活性氧產生,導致視網(wǎng)膜氧化應激、局部炎癥反應增強,進而誘導強有力的炎癥分子ICAM-1表達異常升高,高表達的ICAM-1使白細胞淤滯,白細胞黏附可引起視網(wǎng)膜毛細血管內皮細胞的凋亡,激活血小板,導致血流緩慢和血栓形成、毛細血管無灌注的形成及血視網(wǎng)膜屏障破壞,從而促進DR的發(fā)生發(fā)展〔8〕。

    本研究表明PRD可通過下調視網(wǎng)膜組織ICAM-1的表達,減少視網(wǎng)膜微血管滲漏及病理性新生血管生成,發(fā)揮對糖尿病視網(wǎng)膜微血管損傷的保護作用。由于PRD可發(fā)揮中藥組方多環(huán)節(jié)、多靶位的治療優(yōu)勢,且對人體無毒性,避免了化學合成藥物帶給人體的不良反應,因此可能為DR治療提供新的方法。

    4參考文獻

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    3Wu CF,Xue JR,Lang P.Effects of melatonin on oxidative stress and the expression of ICAM-1 on retina in diabetic rat〔J〕.Chin Ophthal Res,2010;28(4):330-3.

    4龐宗然,趙玉堂,李靜華,等.菩人丹超微粉對肥胖型2型糖尿病大鼠糖代謝相關指標的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2010;16 (5):107-10.

    5龐宗然,劉祖涵,蘇曉惠,等.菩人丹超微粉對肥胖型T2DM大血管損傷大鼠ET-1、NO、FFAs含量的影響〔J〕.中國老年學雜志,2011;31(10):1779-80.

    6向雪松,王竹祝,宇銘,等.鏈脲佐菌素注射劑量對建立2型糖尿病大鼠模型的影響〔J〕.衛(wèi)生研究,2010;39(2):138-42.

    7Pelzek C,Lim JI.Diabetic macular edema:review and update〔J〕.Ophthalmol Clin North Am,2002;15(4):555-63.

    8Zhang XL,Wen L,Chen YJ,etal.Vascular endothelial growth factor up-regulates the expression of intracellular adhesion molecule-1 in retinal endothelial cells via reactive oxygen species,but not nitric oxide〔J〕.Chin Med J(Engl),2009;122(3):338-43.

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    10Zhu Y,Zhang XL,Zhu BF,etal.Effect of antioxidant N-acetylcysteine on diabetic retinopathy and expression of VEGF and ICAM-1 from retinal blood vessels of diabetic rats〔J〕.Mol Biol Rep,2011;28(9):〔Epub ahead of print〕.

    〔2013-08-12修回〕

    (編輯趙慧玲/曹夢園)

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