水通道蛋白-4在抑郁及抗抑郁大鼠模型海馬區(qū)的表達(dá)

水通道蛋白-4在抑郁及抗抑郁大鼠模型海馬區(qū)的表達(dá)

任愛華王海鵬趙華1何欣

(北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林吉林132000)

摘要〔〕目的探討抑郁及抗抑郁模型大鼠海馬區(qū)水通道蛋白(AQP)-4的表達(dá)。方法通過采用慢性不可預(yù)見性刺激和孤養(yǎng)相結(jié)合的方法，在應(yīng)激第21天后對大鼠稱量體重、測24 h糖攝取量，灌流取腦，免疫組化觀察海馬區(qū)AQP-4的變化。結(jié)果抑郁大鼠體重和糖攝取量明顯少于正常對照組及抗抑郁組，抑郁模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡及AQP-4表達(dá)增加。結(jié)論AQP-4在抑郁模型大鼠腦中對抑郁癥的發(fā)病發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞〔〕抑郁癥；海馬；慢性應(yīng)激；水通道蛋白-4

中圖分類號〔〕R74〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：何欣(1957-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)解剖學(xué)研究。

1吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

第一作者：任愛華(1976-)，男，碩士，講師，主要從事神經(jīng)解剖學(xué)研究。

抑郁癥(DEP)是在持續(xù)困境的作用下，可引發(fā)精神障礙，日益受到全社會的普遍關(guān)注并成為研究的熱點〔1〕。本實驗采用不可預(yù)知的長期溫和應(yīng)激刺激(CUMS)和分養(yǎng)2種經(jīng)典模型相結(jié)合的方式制造抑郁模型〔2〕。以往研究〔3~5〕表明抑郁模型大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞再生減少和萎縮。但目前國內(nèi)外對于抑郁患者發(fā)病機制不能完全統(tǒng)一，本實驗在形態(tài)學(xué)上揭示CUMS模型大鼠海馬區(qū)水通道蛋白(AQP)-4表達(dá)的改變，來分析神經(jīng)元凋亡的原因及機制。

1材料和方法

1.1動物、儀器及試劑采用吉林大學(xué)試驗動物研制中心提供的清潔級Wistar雄性大鼠27只，體重180~190 g，清潔級動物飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境清潔且有晝夜光線變化適應(yīng)1 w。電刺激器(蚌埠第二儀器廠)；Tiger 2000圖像分析儀(重慶大學(xué)軟件研究所)；Nikon 數(shù)碼照相機(日本)。S-P試劑盒(福州邁新公司提供)；兔抗AQP-4抗體，由吉林大學(xué)病理生理教研室贈送。氟西汀常州第四制藥廠。

1.2方法

1.2.1動物模型建立、觀察及分組隨機分為正常對照組、抑郁模型組和給藥組大鼠各9只。制備抑郁動物模型的方法：每天隨機實施一種不同的應(yīng)激刺激，包括足底電擊、熱、禁食禁水、疼痛、饑渴、冰水游泳等，持續(xù)21 d。正常對照組不接受刺激。給藥組給予氟西汀治療，量為10 mg/kg,1次/d,皮下注射,共4 w。在第22天對各組進(jìn)行稱量體重及記錄第22天24 h內(nèi)大鼠蔗糖攝取量〔6〕，在應(yīng)激前后都用open- field法進(jìn)行行為評分〔7〕。

1.2.2腦組織取材、固定、切片及表片在第22天兩組大鼠分別用10%水合氯醛行腹腔內(nèi)注射麻醉后，在心尖部注射50 U/100 g的肝素抗凝，用200 ml生理鹽水快速灌注，然后用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注，開顱取腦組織于后固定液(4%多聚甲醛溶液)24 h，行石蠟包埋。連續(xù)冠狀切片，片厚6 μm，隔5取1片，表片，貼片分成3套，56℃恒溫箱干燥。一套用來觀察核團(tuán)部位，一套行AQP-4免疫組化染色，一套備用。

1.2.3SP法免疫組織化學(xué)染色常規(guī)脫蠟、脫水，抗原修復(fù)，玻片上滴加過氧化氫溶液(SP試劑盒中試劑A)，室溫下于濕盒中孵育20 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的作用。0.01 mol/L PBS沖洗，5 min，3次。滴加非免疫動物血清(SP試劑盒中試劑B)，室溫下于濕盒中孵育20 min以減少非特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。0.01 mol/L PBS沖洗，5 min，3次。滴加兔抗大鼠AQP-4工作濃度為1∶50，4℃過夜，0.01 mol/L PBS沖洗，5 min，3次。滴加生物素標(biāo)記羊抗兔(SP試劑盒中試劑C)，室溫下于濕盒中孵育20 min，0.01 mol/L沖洗，5 min，3次。滴加鏈霉素生物素蛋白-過氧化物酶溶液(SP試劑盒中試劑D)，室溫下于濕盒中孵育20 min，0.01 mol/L PBS沖洗，5 min×3次。滴加新配制的二甲基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑。蘇木素復(fù)染。80%、90%乙醇、無水乙醇各3 min脫水。二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min透明。中性樹膠封片。陰性對照采用替代實驗，即用PBS代替一抗來孵育切片，其他步驟相同。

1.2.4AQP-4陽性細(xì)胞的計數(shù)方法陽性神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察及測定，于OLYMPUS顯微鏡下，放大400倍，確定海馬內(nèi)AQP-4陽性神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)及分布。免疫組化染色:染色強度以多數(shù)細(xì)胞為準(zhǔn)，染色陰性為(-)，染色呈淡棕黃色為(+)，深棕黃色為()，深棕褐色為()。圖像分析儀處理:先在每張免疫組化染色切片上，取空白區(qū)，測定背景的灰度值。隨機取20個陽性細(xì)胞，用鼠標(biāo)描繪所測細(xì)胞的胞膜區(qū)域，計算機自動測量灰度。減去背景值再除以20，獲得該切片陽性細(xì)胞的平均灰度值。

2結(jié)果

2.1應(yīng)激對大鼠行為的影響隨應(yīng)激時間的增加，應(yīng)激大鼠逐漸出現(xiàn)行動遲緩、活動減少，食欲不振、對環(huán)境變化失去興趣。在第22天時，觀察大鼠的水平運動、垂直運動及理毛時間及排便次數(shù)與正常對照組相比都明顯減少(P<0.01)。見表1。

表1　應(yīng)激及藥物治療對大鼠open-field行為的影響

與正常對照組第22天比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組第22天比較：3)P<0.01，4)P<0.05

2.2應(yīng)激對大鼠蔗糖攝取量及體重的影響 在應(yīng)激第22天后，模型組蔗糖攝取量〔(0.25±3.99)ml〕及平均體重〔(204.17±9.75)g〕與正常對照組〔(19±3.7)ml,(263.33±16.43)g〕及給藥組〔(17.14±4.15)ml,(251.66±15.22)g〕大鼠比較明顯降低(P<0.05)。

2.3應(yīng)激對大鼠海馬AQP-4免疫組化染色的影響正常對照組大鼠可見海馬和齒狀回各層中，最明顯的是胞體較大的呈三角形的錐體細(xì)胞層和胞體呈圓形或卵圓形的顆粒細(xì)胞層，其排列緊密、規(guī)則，細(xì)胞核清晰可見，胞膜連續(xù)完整，神經(jīng)元排列層次整齊未見神經(jīng)元細(xì)胞核固縮和空泡現(xiàn)象。模型組大鼠海馬各區(qū)神經(jīng)元顆粒細(xì)胞層較正常對照組和給藥組明顯減少，且錐體細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)元排列疏松、散亂，尤其在抑郁組海馬的CA1、CA3、齒狀回神經(jīng)元細(xì)胞減少，較多的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)空泡和核固縮，部分細(xì)胞的脫落形成了空泡。在海馬各區(qū)神經(jīng)元中，以齒狀回神經(jīng)元減少最多，其次為CA1區(qū)。AQP-4在大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回各區(qū)都可以見到，主要局限在星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點的膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞亞群，在血管的周圍膠質(zhì)細(xì)胞的足突呈現(xiàn)強烈的標(biāo)記，呈深棕色，海馬的錐體細(xì)胞層、齒狀回顆粒細(xì)胞層和多形細(xì)胞層上有的表達(dá)，呈棕黃色。抑郁模型組較正常對照組和給藥組海馬區(qū)齒狀回表達(dá)較多，在CA1、CA3區(qū)也明顯增多，見圖1。與正常對照組平均灰度值19.18±2.31相比，模型組大鼠海馬AQP-4平均灰度值顯著升高〔(31.12±3.27)，P<0.05〕，給藥組為23.22±3.13。

正常對照組

模型組

給藥組

3討論

對于評價一個DEP模型的制作是否成功主要依據(jù)動物在行為上的變化〔8〕，本模型中動物經(jīng)22 d慢性綜合性應(yīng)激后，大鼠活動明顯減少；測量在應(yīng)激結(jié)束后大鼠體重及24 h糖攝入量均少與對照組和給藥組；發(fā)現(xiàn)抑郁模型大鼠海馬各區(qū)神經(jīng)元顆粒細(xì)胞層減少，且錐體細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)元排列疏松、散亂。在行為學(xué)和形態(tài)學(xué)上都與國際上診斷抑郁模型標(biāo)準(zhǔn)相一致，表明本實驗中大鼠DEP模型的制作是成功的。

AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)量最多的一類水通道蛋白，主要富集表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞上，調(diào)節(jié)腦脊液體積，同時參與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能〔9〕。目前的觀點認(rèn)為，神經(jīng)干細(xì)胞屬于星形膠質(zhì)細(xì)胞家系中成員之一，其表面同樣高度表達(dá)AQP4〔10〕。AQP4敲除小鼠紋狀體，皮層，海馬內(nèi)谷氨酸、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量明顯改變〔11〕。由此可見AQP4調(diào)節(jié)腦內(nèi)物質(zhì)代謝平衡?？挂钟羲幹委熌芴岣吣X內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的水平，VEGF能促進(jìn)神經(jīng)再生，而且阻斷VEGF信號通路也能抑制抗抑郁藥的促增殖作用〔12〕。 氟西汀是治療抑郁癥的經(jīng)典藥物之一，氟西汀可以逆轉(zhuǎn)應(yīng)激動物模型海馬區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少〔13〕，而且對離體培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞有直接的促增殖作用〔14〕。能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)等神經(jīng)營養(yǎng)因子〔15〕。由以上可以看出AQP-4的這些生理作用對于腦組織維持一個適宜的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是非常重要的。在本實驗中，AQP-4增加可能由于長期刺激使腦內(nèi)環(huán)境改變，同時參與改善腦內(nèi)環(huán)境。在抑郁模型的大鼠的海馬里出現(xiàn)神經(jīng)元的凋亡，凋亡的細(xì)胞釋放過多的K+和血糖(GLU)，這些過多的K+和GLU進(jìn)一步促使AQP-4為維持內(nèi)環(huán)境的平衡穩(wěn)定而適應(yīng)性增加，把過多的K+和GLU轉(zhuǎn)運到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞的死亡和數(shù)目減少，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞給神經(jīng)原細(xì)胞提供營養(yǎng)，所以進(jìn)一步加重了海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡。而氟西汀能夠有效地逆轉(zhuǎn)這種凋亡，是較為肯定的治療藥物。

綜上所述，從本實驗中我們可以看出來AQP-4既參加調(diào)節(jié)抑郁模型大鼠海馬區(qū)內(nèi)環(huán)境，同時對抑郁模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)原的凋亡發(fā)揮作用。氟西汀治療抑郁的機制之一是提升大鼠海馬區(qū)5-HT濃度，進(jìn)而影響AQP-4的表達(dá)，達(dá)到抗抑郁的作用，所以AQP-4既有正面積極的作用，也有負(fù)面影響，這為以后在抑郁癥發(fā)病機制的研究中提供了新的方向。

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〔2013-11-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

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