靈芝酸對鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用

靈芝酸對鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用

王麗欣劉蕾劉君星馬小茹王芳芳梁衍鋒吳佳梅王淑秋齊亞靈

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，黑龍江佳木斯154007)

摘要〔〕目的觀察靈芝酸對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元p-Akt、Akt蛋白表達的影響，并通過應(yīng)用wortmannin阻斷PI3K/Akt通路，探討靈芝酸是否具有抗癲癇作用及其作用機制。方法選取雄性SD大鼠50只，隨機分為5組(n=10)，A組：生理鹽水對照組，B組：癲癇模型組，C組：靈芝酸干預(yù)組，D組：wortmannin抑制劑組，E組：二甲基亞砜(DMSO)對照組。每組給予相應(yīng)藥后，對大鼠進行行為學(xué)觀察、HE染色法檢測海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)學(xué)變化，免疫組化法檢測各組大鼠海馬區(qū)p-Akt、Akt蛋白表達。結(jié)果與A組相比，B、C、D、E組p-Akt、Akt的表達量相對較高(P<0.01)；靈芝酸干預(yù)后，C、D、E組p-Akt、Akt的表達量明顯比B組增高(P<0.05)；PI3K/Akt通路被阻斷后，C、E兩組p-Akt、Akt的表達量明顯比D組增高(P<0.05)。結(jié)論靈芝酸對海馬神經(jīng)元具有一定的保護作用，并且其機制與PI3K/Akt通路的活化并影響其下游蛋白的表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕靈芝酸；癲癇；PI3K/AKT；p-Akt；Akt

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目(LZZ2014_004)

通訊作者：王淑秋(1957-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)免疫內(nèi)分泌的病理生理學(xué)研究。

齊亞靈(1967-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥抗衰老研究。

第一作者：王麗欣(1988-)，女，在讀碩士，主要從事癲癇發(fā)病機制及中藥治療研究。

癲癇主要是由于大腦一過性放電引起的發(fā)作性意識喪失〔1，2〕，其病理改變是海馬神經(jīng)元的損傷。靈芝酸作為靈芝的精華，在20世紀(jì)80年代就被分離并純化 ，并證實其中含有的有效成分可對臨床上多種常見疾病有防治功效，但是關(guān)于靈芝酸對癲癇的防治方面罕有報道。本實驗主要通過給予癲癇模型大鼠腹腔注射靈芝酸，并通過PI3K/Akt通路阻斷劑wortmannin干預(yù)致癇大鼠，觀察大鼠海馬區(qū)Akt、磷酸化Akt(P-Alct)的表達變化，探討靈芝酸對癲癇大鼠的海馬神經(jīng)元是否具有保護作用。

1材料與方法

1.1實驗材料SD大鼠(大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)；靈芝酸(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；p-Akt、Akt抗體(美國santa cruz生物技術(shù)公司)；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(武漢博士德公司)；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟生物科技公司)。

1.2分組與給藥健康雄性SD大鼠50只，體重(180±20)g，隨機分為5組(n=10)，A組：對照組，腹腔注射與氯化鋰等量的生理鹽水，20 h后經(jīng)腹腔注射與靈芝酸等量的生理鹽水，30 min 后注射與硫酸阿托品等量的生理鹽水，30 min后注射與匹魯卡品等量的生理鹽水。B組：癲癇模型組，大鼠腹腔注射氯化鋰(3 mmol/kg)預(yù)處理，20 h后腹腔注射與靈芝酸等量的生理鹽水，60 min后腹腔注射匹魯卡品(80 mg/kg)，在匹魯卡品腹腔注射前30 min給予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹魯卡品導(dǎo)致的外周膽堿能反應(yīng)。C：靈芝酸干預(yù)組，大鼠腹腔注射氯化鋰(3 mmol/kg)預(yù)處理，20 h后腹腔注射靈芝酸(10 mg/kg)，60 min后腹腔注射匹魯卡品(80 mg/kg)，在匹魯卡品腹腔注射前30 min給予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹魯卡品導(dǎo)致的外周膽堿能反應(yīng)。D組：wortmannin抑制劑組，大鼠腹腔注射氯化鋰(3 mmol/kg)預(yù)處理，20 h后腹腔注射靈芝酸(10 mg/kg)，60 min后腹腔注射匹魯卡品(80 mg/kg)，在匹魯卡品腹腔注射前30 min給予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹魯卡品導(dǎo)致的外周膽堿能反應(yīng)。靈芝酸注射前60 min腹腔注射wortmannin(1 mg/kg)。E組：二甲基亞砜(DMSO)對照組，大鼠腹腔注射氯化鋰(3 mmol/kg)預(yù)處理，20 h后腹腔注射靈芝酸(10 mg/kg)，60 min后腹腔注射匹魯卡品(80 mg/kg)，在匹魯卡品腹腔注射前30 min給予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹魯卡品導(dǎo)致的外周膽堿能反應(yīng)。靈芝酸注射前60 min腹腔注射DMSO(0.5 mg/kg)。匹魯卡品注射后大鼠出現(xiàn)Ⅳ、Ⅴ級發(fā)作，并且持續(xù)30 min以上全身性驚厥者視為造模成功。癲癇發(fā)作1 h后根據(jù)分組情況腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)終止發(fā)作，注射止痙劑30 min仍沒有終止發(fā)作，可原劑量重復(fù)注射1次。終止發(fā)作后6 h取材。

1.3取材與標(biāo)本制備癲癇終止后6 h給予水合氯醛過量麻醉大鼠，眼科剪刀開胸后分離心包，找到左心室，動脈導(dǎo)管尖端于心尖部行主動脈插管，剪開右心耳，以便血液及灌注液流出。先注入0.9%生理鹽水約50 ml，待心耳開口流出透明液體時換為4%多聚甲醛50 ml灌流固定大鼠，大鼠出現(xiàn)抽搐時方可開顱取腦，并置于甲醛溶液中放入4℃冰箱二次固定。24 h后去海馬部行石蠟包埋，切片機冠狀連續(xù)切片，切至所需海馬組織，每片厚度為5 μm，放入恒溫干燥箱中8 h后分別進行HE及免疫組化染色。

1.4海馬組織病理學(xué)觀察①HE染色。切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，常規(guī)蘇木素、伊紅染色，透明，封片，光鏡下觀察海馬區(qū)細胞結(jié)構(gòu)。②免疫組織化學(xué)染色將切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，抗原熱修復(fù)，滴加5%BSA封閉液37℃孵育20 min，加入p-Akt、Akt一抗4℃過夜，次日加入二抗、SABC、DAB顯色劑，最后用蘇木素輕度復(fù)染，用PBS代替一抗作為陰性對照。鏡下觀察海馬神經(jīng)細胞中p-Akt及Akt蛋白的表達。每一標(biāo)本隨機取3張切片，每張切片隨機取5個不重復(fù)的視野，分別對染色的陽性細胞計數(shù)，然后取3張切片陽性細胞數(shù)的均值作為該標(biāo)本結(jié)果，以每組5例樣本觀察結(jié)果的平均值作為每組的實驗結(jié)果。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1大鼠行為學(xué)觀察除A組外，各組大鼠基本達到Ⅳ級以上癲癇發(fā)作水平。表現(xiàn)為后肢站立、前肢陣攣；四肢抽搐并跌倒、旋轉(zhuǎn)，并且持續(xù)發(fā)作30 min以上，其中死亡13只，未達發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)5只，均予以隨機替換補充。

2.2HE染色結(jié)果光鏡下可見A組大鼠海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)神經(jīng)元呈多層分布，椎體細胞及顆粒細胞排列緊密，形態(tài)正常，胞體呈圓形或橢圓形，細胞樹突稠密，側(cè)支豐富。B組神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，排列紊亂，胞體變小甚至破裂，核固縮，神經(jīng)元發(fā)生變形。B組較C、D、E組海馬神經(jīng)元變性、壞死的數(shù)量和程度要重，并且D組損傷的程度較C組和E組重。見圖1。

2.3免疫組化結(jié)果兩種蛋白均在胞質(zhì)中表達，胞膜和胞核僅有少量表達。A組胞質(zhì)中偶有棕黃色顆粒分布。見圖2。其余四組中p-Akt、Akt的陽性細胞數(shù)均顯著多于A組(P<0.01)，胞核中偶見棕黃色顆粒。C、D、E組中兩種蛋白的陽性細胞數(shù)明顯比B組增多(P<0.05)。且C、E組中兩種蛋白的陽性細胞數(shù)較D組增多(P<0.05)；C組中兩種蛋白的陽性細胞數(shù)雖多于E組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

圖1　各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元(HE，×200)

圖2　海馬CA1區(qū)Akt、p-Akt蛋白表達(SABC，×200)

表1　各組大鼠海馬區(qū)p-Akt、Akt陽性細胞計數(shù)

與A組相比：1)P<0.01；與B組相比：2)P<0.05；與D組相比：3)P<0.05

3討論

到目前為止主要還是應(yīng)用抗癲癇藥物來控制癲癇發(fā)作，手術(shù)治療為輔，但無論是藥物治療還是手術(shù)治療都會對患者造成一定程度的不良影響，靈芝是一種珍貴的天然藥用真菌，其中主要含有三萜類、酶類及微量元素等近千種化合物〔3〕，其中三萜類、多糖類等具有生物學(xué)活性的成分已被分離、提取。最近研究發(fā)現(xiàn)，靈芝在抑制炎癥反應(yīng)〔4〕、抗腫瘤〔5〕及調(diào)節(jié)人體糖代謝〔6〕等方面都發(fā)揮著一定功效，并且靈芝酸還可通過降低癇樣放電海馬神經(jīng)元中ERK1/2的磷酸化水平從而達到保護海馬神經(jīng)元的作用〔7〕。

PI3K/Akt信號通路是人體內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路，已被證實在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中都發(fā)揮著重要的作用，而p-Akt與Akt作為其通路中重要的下游蛋白，不僅可以促進神經(jīng)元的存活還具有一定的抗凋亡作用〔8〕。Wortmannin作為PI3K/Akt信號通路的抑制劑，可抑制p-Akt與Akt的表達。本實驗說明靈芝酸對海馬神經(jīng)元具有一定的保護作用。靈芝酸是通過PI3K/Akt途徑對海馬神經(jīng)元起到保護作用的，其作用機制與PI3K/Akt通路有關(guān)，并在應(yīng)用wortmannin后更加證實了這一點，這為以后抗癲癇藥物的研究提供了新的靶點。

4參考文獻

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7欒倩，劉蕾，劉君星，等.靈芝酸對癇樣放電海馬神經(jīng)元ERK1/2磷酸化水平的影響〔J〕.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2014;37(2)：1-3.

8史志勤，王維平，于江華，等.重組人紅細胞生成素經(jīng)PI3K/Akt途徑對大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的保護作用〔J〕.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2009;18(1)：94-102.

〔2013-12-17修回〕

(編輯苑云杰)