羅格列酮對人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤的影響及機(jī)制

羅格列酮對人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤的影響及機(jī)制

張萌彭利喬治斌何宏濤周燁徐卓

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科，河北石家莊050011)

摘要〔〕目的探討羅格列酮對人肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的影響和可能機(jī)制。方法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為羅格列酮組及對照組。觀察移植瘤生長情況，HE染色觀察移植瘤細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析細(xì)胞周期及凋亡情況，Western印跡法檢測移植瘤細(xì)胞中第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(PTEN)、磷酸化蛋白激酶B(pAkt)、S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)及細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑P27kip1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果研究結(jié)束時，羅格列酮組移植瘤體積與重量均明顯小于對照組，體積抑制率為52.13%，重量抑制率為65.63%。羅格列酮組移植瘤細(xì)胞G0/G1期比例及凋亡率均顯著高于對照組 (P<0.05)。羅格列酮組移植瘤細(xì)胞PTEN及P27kip1蛋白的表達(dá)量明顯高于對照組，pAkt及Skp2蛋白表達(dá)量明顯低于對照組(P<0.05)。結(jié)論羅格列酮對人肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長有抑制作用，可引發(fā)移植瘤細(xì)胞G0/G1期阻滯并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與羅格列酮上調(diào)PTEN蛋白的表達(dá)，抑制PI3K/Akt信號通路，下調(diào)Skp2蛋白，導(dǎo)致P27kip1蛋白水平升高有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕羅格列酮；肝細(xì)胞癌；第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因；磷酸化蛋白激酶B；S期激酶相關(guān)蛋白2；細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑P27kip1

中圖分類號〔〕R735.7；R73-361〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：河北省高校強(qiáng)勢特色學(xué)科資助項目(2005-52)；河北省衛(wèi)生廳資助課題(06142)

通訊作者：彭利(1972-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事肝膽腫瘤研究。

第一作者：張萌(1977-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事肝膽腫瘤的研究。

最近研究在體外實驗中發(fā)現(xiàn)噻唑啉二酮類(TZDs)藥物可通過激活PPAR-γ發(fā)揮抑制腫瘤增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等作用〔1〕。而其對肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤是否具有類似作用及相關(guān)機(jī)制的體內(nèi)研究則未見報道。本實驗通過構(gòu)建人肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，觀察TZDs典型藥物羅格列酮對移植瘤生長及細(xì)胞周期和凋亡的影響，檢測PTEN、pAkt、Skp2及P27kip1蛋白表達(dá)的變化，探討羅格列酮對裸鼠皮下移植瘤生長的作用及可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1 主要材料與試劑人肝癌細(xì)胞系HepG2由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。BALB/c-nu/nu裸小鼠，共10只，4周齡，雄性，體重18~22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(動物許可證編號：SCXK京2009-0007)。于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實驗動物中心〔動物實驗室合格證號：(SYXK(冀)2008-0051〕，SPF級層流柜內(nèi)分籠飼養(yǎng)。羅格列酮(商品名：文迪雅)購自葛蘭素史克(天津)有限公司。PTEN兔抗人單克隆抗體、pAkt(pS473)兔抗人單克隆抗體購自美國Epitomics公司，Skp2 p45(H-435)兔抗人多克隆抗體、P27kip1(F-8)鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞的制備及荷瘤裸鼠動物模型的建立用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞。取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰酶對單層細(xì)胞進(jìn)行消化，充分吹打后，無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，1 500 r/min，離心5 min，重懸于生理鹽水中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×1010/L，用1 ml空針以每只0.2 ml(4×106個細(xì)胞)于裸小鼠左側(cè)肩胛部皮下注射建立移植瘤模型。

1.3 實驗分組及藥物干預(yù)待移植瘤生長至約100 mm3時，將10只裸鼠隨機(jī)分為羅格列酮組和對照組(每組5只)。羅格列酮組給予30 mg/kg羅格列酮(生理鹽水溶解)每天1次灌胃，對照組給予相應(yīng)體積生理鹽水每天1次灌胃。

1.4 裸鼠體內(nèi)成瘤觀察實驗過程中每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長徑(a)和最短徑(b)，按公式計算裸鼠移植瘤體積：V=a×b2/2，并計算相對移植瘤體積(RTV)，RTV=Vt/ V0。V0為分組給藥時測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。實驗結(jié)束后采用斷頸法統(tǒng)一處死裸鼠，剝離腫瘤，稱重，計算腫瘤生長抑制率，體積抑制率(%)=(對照組平均瘤體積-羅格列酮組平均瘤體積)/對照組平均瘤體積×100%。重量抑制率(%)=(對照組平均瘤重-羅格列酮組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.5 移植瘤組織HE染色移植瘤標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定、浸蠟、包埋后，常規(guī)病理切片，行HE染色，光鏡觀察。

1.6 FCM檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞懸液，PBS洗滌樣品，調(diào)整每份樣品的細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，PI染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀，應(yīng)用Muticycle AV軟件對凋亡及細(xì)胞周期進(jìn)行分析。在二倍體細(xì)胞峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰判定為凋亡細(xì)胞峰，以凋亡率表示凋亡狀態(tài)。依據(jù)DNA細(xì)胞周期擬合分析所得組方圖，計算出各時相分布的百分比。

1.7 Western印跡法檢測PTEN、pAkt、Skp2及P27kip1蛋白表達(dá)冰浴下各移植瘤組織塊與細(xì)胞裂解液在勻漿器中反復(fù)研磨(每100 mg組織加400 μl RIPA裂解液)，提取總蛋白。蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)方法，根據(jù)考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗。

2結(jié)果

圖1　羅格列酮對肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用

2.1 羅格列酮對肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用接種人肝癌HepG2細(xì)胞后，裸鼠皮下注射處2 d后局部水腫消失，5 d后全部成瘤，成瘤率達(dá)100%。移植瘤呈圓形或結(jié)節(jié)形。初期瘤體表面光滑，隨著瘤體逐漸增大，藥物干預(yù)5 w后發(fā)現(xiàn)部分裸鼠瘤體表面潰破、結(jié)痂。為避免混雜性偏倚，在連續(xù)給藥5 w、即觀察時間共計6 w時終止實驗。荷瘤裸鼠生長狀態(tài)良好，飲食及活動正常，無其他明顯不良反應(yīng)。羅格列酮組的裸鼠RTV低于對照組(P<0.05)(圖1、圖2)。實驗結(jié)束時羅格列酮對裸鼠移植瘤的最大體積抑制率為52.13%，重量抑制率為65.63%。見表1。

與羅格列酮組比較：1)P<0.05 圖2　移植瘤生長曲線

組別RTV(Vt/V0)移植瘤重量(g)抑制率(%)體積重量對照組14.82±5.723.55±1.31--羅格列酮組8.02±1.521)1.22±0.551)52.1365.63

與對照組比較:1)P<0.05；下表同

2.2 裸鼠移植瘤的光鏡形態(tài)學(xué)觀察羅格列酮組及對照組移植瘤鏡下觀察未見明顯區(qū)別：移植瘤細(xì)胞異型性明顯，瘤組織少量壞死，局限于中央?yún)^(qū)域。瘤細(xì)胞之間排列緊密，大小不一，形態(tài)不規(guī)則。細(xì)胞核染色質(zhì)呈粗顆粒狀，核仁較大，清晰，偶見瘤巨細(xì)胞，核分裂像多見。見圖3。

圖3　不同組別裸鼠移植瘤光鏡下形態(tài)觀察(HE，×400)

2.3 羅格列酮對裸鼠移植瘤細(xì)胞周期和凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，羅格列酮組移植瘤細(xì)胞凋亡率高于對照組，羅格列酮組移植瘤G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高，S期細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)，而G2/M期細(xì)胞比例無明顯變化。見表2。

表2　羅格列酮對移植瘤細(xì)胞凋亡和

2.4 裸鼠移植瘤PTEN、pAkt、Skp2及P27kip1蛋白的表達(dá)羅格列酮組裸鼠移植瘤組織中pAkt和Skp2蛋白表達(dá)量均低于對照組，PTEN和P27kip1蛋白表達(dá)量高于對照組(P<0.05) 。見圖4、表3。

圖4　不同組別裸鼠移植瘤中PTEN,pAkt,Skp2 和P27 kip1 蛋白的表達(dá)(Western blot)

組別PTEN蛋白pAkt蛋白Skp2蛋白P27kip1蛋白對照組0.20±0.141.55±0.241.49±0.280.39±0.11羅格列酮組0.47±0.221)0.83±0.201)0.65±0.161)0.96±0.251)

與對照組比較：1)P<0.05

3討論

近年來，PPAR-γ配體的抗腫瘤作用受到越來越多的重視，此類作用與PPAR-γ激活后參與調(diào)控多條信號通路有密切關(guān)系，但具體的作用機(jī)制并不清楚〔2〕。PPAR-γ的合成配體以噻唑烷二酮類藥物為主要代表，其中羅格列酮對PPAR-γ的親和力最大，特異性最強(qiáng)。已有研究證實，羅格列酮可抑制人肝癌MHCC97L、BEL-7404細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡〔3〕。

前期研究已經(jīng)證實，PPAR-γ蛋白在人肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)升高，且與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有一定關(guān)系〔4〕，其激動劑羅格列酮可在體外抑制人肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并使其發(fā)生G0/G1期阻滯〔5〕。為了進(jìn)一步研究羅格列酮的體內(nèi)抑瘤作用，本實驗采用肝癌細(xì)胞株移植瘤的方法，于裸鼠皮下接種一定數(shù)量的HepG2細(xì)胞，成功構(gòu)建了肝癌荷瘤裸鼠模型。根據(jù)文獻(xiàn)采用每天1次灌胃法，觀察裸鼠移植瘤的變化〔6〕，提示羅格列酮對人肝癌細(xì)胞HepG2的裸鼠移植瘤有明顯的生長抑制作用。且可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2的裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1期阻滯，推測這可能是羅格列酮抑制裸鼠移植瘤生長的內(nèi)在機(jī)制。但是光鏡下觀察并未發(fā)現(xiàn)兩組存在明顯差別，我們認(rèn)為這符合實體瘤的鏡下表現(xiàn)。

Jagan等〔7〕的研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮可以上調(diào)人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞中PTEN的表達(dá)，且可被PPAR-γ抑制劑GW9662逆轉(zhuǎn)，證實羅格列酮的該效應(yīng)是通過激活PPAR-γ實現(xiàn)的。PTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一具有脂質(zhì)磷酸酶與蛋白磷酸酶兩種活性的抑癌基因，在誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及遷移、分化等諸方面均起重要的作用〔8〕。脂質(zhì)磷酸酶活性是PTEN抑制腫瘤的主要功能基礎(chǔ)，PTEN可通過該活性降解PI3K活化產(chǎn)生的信使PIP3，使其去磷酸化為PIP2，失去對Akt的激活，維持pAkt的低水平，從而抑制PI3K/Akt通路〔9〕。PI3K/Akt信號通路在廣泛的人類腫瘤中表達(dá)失調(diào)，是十分重要的凋亡抑制通路，而作為該通路效應(yīng)核心的pAkt可以通過多種機(jī)制激活Skp2〔10〕。Skp2的激活將加速降解細(xì)胞周期抑制蛋白P27kip1，使細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，導(dǎo)致癌變的發(fā)生〔11〕。本實驗結(jié)果與上述學(xué)者的研究結(jié)論基本一致，提示羅格列酮促使移植瘤細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與其上調(diào)PTEN的表達(dá)水平，抑制PI3K/Akt信號通路，下調(diào)Skp2蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致P27kip1蛋白水平升高有關(guān)。

另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ配體可以通過其他信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。Shim等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮及15d-PGJ2可抑制乙型肝炎相關(guān)性肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，此作用是通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞中凋亡促進(jìn)蛋白Bax及Bad的表達(dá)，降低凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)實現(xiàn)的。Bren-Mattison等〔13〕發(fā)現(xiàn)PPAR-γ配體可通過抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中核因子NF-κB的活性，降低環(huán)氧合酶-2的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，有關(guān)PPAR-γ配體抗腫瘤作用的分子機(jī)制及所產(chǎn)生的網(wǎng)絡(luò)交互作用仍需進(jìn)行深入研究。

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〔2013-12-20修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)