Akt-GSK3β細胞信號通路在血管性癡呆大鼠認(rèn)知障礙中的作用機制

Akt-GSK3β細胞信號通路在血管性癡呆大鼠認(rèn)知障礙中的作用機制

趙雪艷

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南開封475000)

摘要〔〕目的探討Akt-GSK3β細胞信號通路在血管性癡呆大鼠認(rèn)知障礙中的作用機制。方法通過Morris水迷宮實驗、跳臺實驗以及生化指標(biāo)測定比較模型組和正常組的差異，分析Akt-GSK3β細胞信號通路的作用機制。結(jié)果模型組逃避潛伏期、通過原平臺次數(shù)、原平臺所在象限停留百分比與正常組差異顯著(P<0.05)；模型組的反應(yīng)時間、學(xué)習(xí)錯誤次數(shù)、潛伏時間、記憶錯誤次數(shù)與正常組差異顯著(P<0.05)；術(shù)后2、4、6 w模型組視野內(nèi)正常神經(jīng)元數(shù)目均明顯低于同時期的正常組；術(shù)后2 w、術(shù)后4 w模型組的p-Akt蛋白表達和p-GSK-3β蛋白表達明顯高于同時期正常組(P<0.05)。結(jié)論對于血管性癡呆大鼠，Akt-GSK3β細胞信號通路可調(diào)控細胞凋亡，在保護神經(jīng)元和改善認(rèn)知的過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞〔〕血管性癡呆；信號通路

中圖分類號〔〕R743〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

第一作者：趙雪艷(1975-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病、神經(jīng)免疫學(xué)研究。

血管性癡呆(VD)是由于出血性腦血管病、缺血性腦血管病等導(dǎo)致的持續(xù)性、獲得性智能障礙綜合征，主要臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶功能障礙〔1～3〕。在我國，腦血管病呈逐年上升的趨勢，VD作為老年期癡呆的主要組成部分給人們帶來嚴(yán)重的心理和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)〔4,5〕。研究表明腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可激活下游Akt-GSK3β信號通路發(fā)揮抗細胞凋亡作用，保護神經(jīng)元。本研究探討Akt-GSK3β細胞信號通路在VD大鼠認(rèn)知障礙中的作用機制。

1資料和方法

1.1實驗動物8月齡昆明種大鼠，雌雄各半，體重(21±2)g。實驗前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)于通風(fēng)、干燥、安靜的環(huán)境中，普通飼料喂養(yǎng)。實驗前為排除有游泳障礙的動物，將大鼠放入水迷宮內(nèi)自由游泳30 s。

1.2方法

1.2.1動物分組將動物隨機分成正常組30只和模型組30只，正常組、模型組根據(jù)不同時期分為術(shù)后2 w、4 w、6 w三個小組，每組10只，共30只。

1.2.2模型制備大鼠腹腔注射350 mg/kg 10%水合氯醛進行麻醉，頸部消毒，切開頸部皮膚及皮下組織，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，用4號絲線同時結(jié)扎阻斷雙側(cè)血流20 min，之后松開絲線恢復(fù)血流10 min，然后再次阻斷20 min，恢復(fù)10 min，如此進行3次。相當(dāng)于進行3次20 min缺血，3次10 min再灌注。大鼠心跳、呼吸平穩(wěn)后縫合皮膚，正常飼養(yǎng)72 h后不死亡就作為模型組。

1.2.3行為學(xué)測試術(shù)后對正常組和模型組進行行為學(xué)測試，分別為Morris水迷宮實驗和跳臺實驗，測試均在光線偏暗、安靜的環(huán)境下進行。

Morris水迷宮實驗：水迷宮主要由一個一個圓形水池和可移動位置的平臺組成。水池高45 cm，直徑80 cm，平臺直徑6 cm。注入清水到水池中至水深30 cm，平臺低于水面1 cm。加入牛奶使池水變?yōu)椴煌该魅榘咨?，使大鼠無法看到乳白色平臺。將水池平均分為4個象限，任選的一個象限把平臺放置于中央。測試內(nèi)容包括：①定位航行實驗：每天上、下午各1次，歷時4 d，每個象限均進行1次。選擇任一象限將大鼠面向池壁放入水中，大鼠找到平臺后記錄時間，即為逃避潛伏期。讓大鼠在平臺上休息15 s，如果60 s后還無法找到平臺，幫助大鼠上平臺休息15 s。休息之后按順時針順序到下一個象限進行實驗。②空間探索實驗：第5天把平臺撤除，從任一點將大鼠放入水中，觀察60 s內(nèi)大鼠在原平臺所在象限的停留時間百分比，計算通過原平臺位置次數(shù)和。

跳臺實驗：被動回避反應(yīng)箱為10 cm×10 cm×40 cm，箱底放置可通電銅柵，銅柵直徑3 mm。反應(yīng)箱一角距離箱底4.5 cm處放置一直徑為4.5 cm的絕緣橡皮墊，作為回避電擊的安全臺。先將大鼠放入箱內(nèi)適應(yīng)3 min，之后給銅柵通36 V交流電，持續(xù)5 min。每天上、下午各1次，歷時4 d，記錄大鼠受電擊后第一次找到安全臺的時間作為反應(yīng)時間，5 min內(nèi)跳下安全臺的次數(shù)作為學(xué)習(xí)錯誤次數(shù)。第5天直接將大鼠放在安全臺上，同時給銅柵通電，持續(xù)5 min。記錄大鼠第一次從安全臺跳到銅柵上的時間作為潛伏時間，5 min內(nèi)跳下安全臺的次數(shù)作為記憶錯誤次數(shù)。

1.2.4正常神經(jīng)元計數(shù)兩項行為學(xué)檢測結(jié)束后，立即斷髓處死大鼠，迅速取出腦組織，制備石蠟組織標(biāo)本。每只大鼠選取2張相同部位的切片，在10×40倍光鏡下觀察海馬CA1區(qū)的2個連續(xù)視野，計算各視野正常神經(jīng)元數(shù)目。神經(jīng)元正常標(biāo)準(zhǔn)為細胞核無細胞皺縮和水腫表現(xiàn)、呈圓形或橢圓形。

1.2.5術(shù)后p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達標(biāo)本選取自斷髓處死大鼠的海馬組織，提取蛋白，應(yīng)用Western印跡技術(shù)檢測p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達，試劑分別使用p-Akt Ser473抗體、GSK-3β抗體和p-GSK-3β Ser9抗體。p-Akt為活化Akt，p-GSK-3β為磷酸化GSK-3β。以術(shù)后2 w正常組數(shù)據(jù)為1，各組P-AKt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達與術(shù)后2 w正常組的比值作為其表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0軟件行t及χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠行為學(xué)測試結(jié)果比較模型組的逃避潛伏期明顯高于正常組(P<0.05)；模型組通過原平臺次數(shù)、原平臺所在象限停留百分比明顯低于正常組(P<0.05)。見表1。模型組的反應(yīng)時間、學(xué)習(xí)錯誤次數(shù)、記憶錯誤次數(shù)明顯高于正常組(P<0.05)；模型組的潛伏時間明顯低于正常組(P<0.05)。見表2。

2.2兩組大鼠腦組織正常神經(jīng)元計數(shù)比較術(shù)后2 w、術(shù)后4 w、術(shù)后6 w模型組視野內(nèi)正常神經(jīng)元數(shù)目均明顯低于同時期的正常組(P<0.05)。見表3。

2.3各組p-Akt蛋白表達術(shù)后2 w、術(shù)后4 w模型組的p-Akt蛋白表達明顯高于同時期的正常組(P<0.05)；術(shù)后6 w模型組的p-Akt蛋白表達與同時期的正常組的差異不明顯(P>0.05)。見表4。

表1　兩組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較

表2　兩組大鼠跳臺實驗結(jié)果比較

表3　兩組大鼠腦組織正常神經(jīng)元數(shù)目比較 ± s, n=10)

表4　兩組術(shù)后p-Akt蛋白表達的比較

2.4各組GSK-3β蛋白表達術(shù)后2 w、術(shù)后4 w、術(shù)后6 w模型組的GSK-3β蛋白表達與同時期的正常組的差異不明顯(P>0.05)。見表5。

表5　兩組術(shù)后GSK-3β蛋白表達的比較

2.5各組p-GSK-3β蛋白表達術(shù)后2 w、術(shù)后4 w模型組的p-GSK-3β蛋白表達明顯高于同時期的正常組(P<0.05)；術(shù)后6 w模型組的p-GSK-3β蛋白表達與同時期的正常組的差異不明顯(P>0.05)。見表6。

表6　兩組術(shù)后p-GSK-3β蛋白表達的比較

3討論

VD會嚴(yán)重影響患者的日常生活能力、生活質(zhì)量和社會職業(yè)功能，增加醫(yī)藥費用，縮短患者壽命，加重家庭和社會的負(fù)擔(dān)，其主要表現(xiàn)為語言、記憶、認(rèn)知能力、視覺功能、人格或情商等方面的改變，特別是以高級認(rèn)知功能減退、記憶喪失為主〔5～8〕。癡呆已經(jīng)成為繼腦卒中、癌癥和心血管病之后的第四大死亡殺手〔9〕。

短暫性腦缺血可導(dǎo)致靜止性梗死、細胞凋亡、選擇性神經(jīng)元壞死，如果出現(xiàn)反復(fù)發(fā)生的情況，會導(dǎo)致認(rèn)知下降。由缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷會導(dǎo)致炎性反應(yīng)，作為神經(jīng)生長因子的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達在腦缺血時會出現(xiàn)增高，結(jié)合細胞膜表面的酪氨酸激酶受體B(TrkB)，從而激活下游的PI3K-Akt信號通路。文獻報道證實，腦缺血后的神經(jīng)元凋亡過程中有PI3K-Akt信號通路的參與，學(xué)習(xí)記憶與PI3K-Akt信號通路存在密切相關(guān)性〔10〕。PI3K-Akt信號通路是細胞中一種重要的存活/凋亡途徑，參與細胞有絲分裂、分化、遷移和存活〔11〕。GSK-3是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有多種功能〔12〕。GSK-3α和GSK-3β是GSK-3主要的2種亞型，GSK-3β屬于Akt下游主要靶激酶之一，包含十幾種轉(zhuǎn)錄因子，可磷酸化幾十種蛋白，是細胞內(nèi)多種信號通路的重要組成成分。GSK-3β誘導(dǎo)凋亡途徑主要包括：抑制促存活轉(zhuǎn)錄因子，促進促凋亡轉(zhuǎn)錄因子；激活凋亡相關(guān)蛋白激酶；磷酸化eIF2B而抑制蛋白合成。PI3K-Akt信號通路在調(diào)控凋亡過程中會對GSK-3β產(chǎn)生很大的影響，GSK-3β的Ser9位點會被激活的Akt磷酸化，下調(diào)GSK-3β的活性，磷酸化β連環(huán)蛋白，促進細胞生存。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過反復(fù)腦缺血再灌注手術(shù)的大鼠，其海馬CA1區(qū)的正常神經(jīng)元數(shù)目明顯少于正常組大鼠，術(shù)后4 w的正常神經(jīng)元數(shù)目最少。Black〔13〕研究認(rèn)為與學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系密切的海馬神經(jīng)元對反復(fù)腦缺血再灌注損傷的敏感性最高，本研究結(jié)果與該報道相一致。在這一病理改變的影響下，正常組和模型組的Morris水迷宮實驗、跳臺實驗結(jié)果差異顯著。Morris水迷宮實驗中模型組的逃避潛伏期明顯高于正常組，通過原平臺次數(shù)、原平臺所在象限停留百分比明顯低于正常組。跳臺實驗中模型組的反應(yīng)時間、學(xué)習(xí)錯誤次數(shù)、記憶錯誤次數(shù)明顯高于正常組，潛伏時間明顯低于正常組。范鳴玥〔14〕通過線栓法再灌注大腦建立血管性癡呆大鼠模型行Morris水迷宮實驗，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯差于正常組。Endo等〔15〕研究顯示，對缺血敏感的海馬CA1區(qū)總GSK-3β的表達未發(fā)生變化，而p-GSK-3β的表達增加。本研究與上述研究結(jié)果一致，提示對于VD大鼠，Akt-GSK3β細胞信號通路可調(diào)控細胞凋亡，在保護神經(jīng)元和改善認(rèn)知的過程中發(fā)揮重要作用。

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〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)