三七總皂苷對丙泊酚麻醉大鼠術(shù)后認(rèn)知功能及海馬NGF、BDNF表達(dá)的影響

三七總皂苷對丙泊酚麻醉大鼠術(shù)后認(rèn)知功能及海馬NGF、BDNF表達(dá)的影響

馮念海唐俊霞

(淄博市中心醫(yī)院麻醉科，山東淄博255036)

摘要〔〕目的探究三七總皂苷對對丙泊酚麻醉大鼠術(shù)后認(rèn)知功能及海馬組織神經(jīng)生長因子(NGF)、腦神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)變化的影響。方法80只雄性大鼠隨機(jī)分為正常對照組(N組),正常大鼠丙泊酚麻醉2 h組(B組),腹部探查組(P組),丙泊酚麻醉2 h腹部探查后給予三七總皂苷組(S組)。麻醉各組給予大鼠丙泊酚100 mg/kg腹腔注射。S組三七總皂苷劑量為10 mg/d，濃度為10 mg/ml，1次/d，連續(xù)7 d，檢測各組大鼠的認(rèn)知功能和NGF、BDNF的表達(dá)水平。結(jié)果術(shù)后3 d麻醉各組大鼠的逃逸潛伏期均明顯增加(P<0.05);B組和S組術(shù)后7 d與術(shù)后3 d結(jié)果有顯著差異(P<0.05)。與術(shù)前1 d相比，術(shù)后3 d麻醉各組穿臺次數(shù)均明顯減少(P<0.05);術(shù)后7 d與術(shù)后3 d相比,B組和S組的穿臺次數(shù)均增加(P<0.05)。術(shù)后3 d，B、P、S組的NGF、BDNF mRNA相對表達(dá)量較N組顯著降低(P<0.05);與術(shù)后3 d相比，術(shù)后7 d B、S、P組的NGF、BDNF mRNA相對表達(dá)量明顯上升(P<0.05)。結(jié)論三七總皂苷對丙泊酚麻醉大鼠術(shù)后認(rèn)知功能有改善作用，促進(jìn)海馬NGF、BDNF表達(dá)。

關(guān)鍵詞〔〕三七總皂苷；丙泊酚；術(shù)后認(rèn)知功能；神經(jīng)生長因子；腦神經(jīng)營養(yǎng)因子

中圖分類號〔〕R614〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

第一作者：馮念海(1968-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事老年麻醉研究。

丙泊酚通過激活GABA受體-氯離子復(fù)合物發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用〔1〕，普遍用于麻醉誘導(dǎo)、麻醉維持、ICU危重病人鎮(zhèn)靜,因?yàn)槠淦鹦а杆?、誘導(dǎo)平穩(wěn)、蘇醒快且功能恢復(fù)完善、術(shù)后惡心嘔吐發(fā)生率低〔2〕,現(xiàn)被廣泛用于臨床麻醉的誘導(dǎo)及維持、區(qū)域麻醉的鎮(zhèn)靜、門診小手術(shù)和內(nèi)鏡檢查的短時(shí)間麻醉。隨著醫(yī)療水平的不斷提高，圍術(shù)期的并發(fā)癥和死亡率明顯降低，但術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)的發(fā)生率一直居高不下〔3〕。但現(xiàn)在臨床上還沒有防止POCD發(fā)生的特別有效的措施。三七(Panaxnotoginseng),味甘、苦、性溫,歸肝、胃經(jīng),能散癖止血,消腫止痛〔4〕;主要成分包括阜苷、多糖、黃酮、三七素等,其中的主要活性成分是三七總皂苷(PNS)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,PNS具有擴(kuò)張外周血管、抑制血栓形成、降低血壓等作用。已經(jīng)證實(shí)PNS對腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用〔5〕，但其對于丙泊酚麻醉后POCD的影響研究尚少。本研究通過觀察丙泊酚麻醉大鼠術(shù)后認(rèn)知功能及海馬組織神經(jīng)生長因子(NGF)、腦神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)變化，探究PNS對丙泊酚麻醉后POCD的影響。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級SD大鼠85只，雄性，8～10周齡，體重200～220 g，購于中國科學(xué)院上海動(dòng)物中心，光/暗周期為12 h/12 h,動(dòng)物自由飲水進(jìn)食。

1.2儀器及試劑丙泊酚(AstraZeneca UK Limited)、PNS、頭孢曲松鈉(蘇州東瑞制藥有限公司)、Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)、鹽酸布比卡因注射液。

1.3分組及給藥方案80只大鼠隨機(jī)分為正常對照組(N組),正常大鼠丙泊酚麻醉2 h組(B組),腹部探查組(P組),丙泊酚麻醉2 h腹部探查后給予PNS組(S組)，每組各19只。麻醉各組給予大鼠丙泊酚100 mg/kg腹腔注射。S組PNS劑量為10 mg/d，濃度為10 mg/ml，1次/d，連續(xù)7 d。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1術(shù)前Morris水迷宮訓(xùn)練及測試術(shù)前5 d開始對85只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練。訓(xùn)練第1天將大鼠放入水溫為(24±2℃)的水中自由游泳，以熟悉環(huán)境,減少應(yīng)激反應(yīng)。待大鼠熟悉環(huán)境后引導(dǎo)大鼠上固定平臺,平臺固定于第3象限,停留20 s后推入水中,待其再次找到平臺。訓(xùn)練3 d后,第4天Morris水迷宮選出訓(xùn)練合格的大鼠。以40 s內(nèi)找到固定平臺為合格。共選出76只合格大鼠,每組19只。第5天測試每組大鼠的定位航行能力和空間探索能力。

定位航行實(shí)驗(yàn):將每組大鼠分別從NE(Ⅰ)、SE(Ⅱ)、NW(Ⅳ)坐標(biāo)象限內(nèi)標(biāo)定的入水點(diǎn)將大鼠面放入水中,頭朝向同側(cè),記錄其尋找平臺的時(shí)間,即逃避潛伏期(代表認(rèn)知能力中的學(xué)習(xí)能力)。如超過120 s未能找到平臺,按120 s計(jì)算。最終結(jié)果取平均值。

空間探索實(shí)驗(yàn):定位航行實(shí)驗(yàn)后,實(shí)驗(yàn)參數(shù)不變,撤去平臺,取第Ⅰ象限為入水點(diǎn),將大鼠放入水中,記錄其在120 s內(nèi)運(yùn)動(dòng)軌跡及相應(yīng)參數(shù)(第Ⅲ象限時(shí)間百分比、第Ⅲ象限路程、穿越平臺次數(shù))，代表認(rèn)知能力中的記憶能力。

1.4.2麻醉及手術(shù)測試結(jié)束后第2日對每組大鼠進(jìn)行干預(yù),前一晚所有大鼠禁食水。給藥方式為腹腔注射。N組給予生理鹽水；B組大鼠給予丙泊酚100 mg/kg麻醉誘導(dǎo),保持大鼠自主呼吸,注意保暖，維持麻醉2 h，如有體動(dòng)反應(yīng)追加丙泊酚50 mg/kg。P組大鼠腹腔注射丙泊酚100 mg/kg行麻醉誘導(dǎo),保持自主呼吸,觀察呼吸動(dòng)度等,注意保暖。對大鼠進(jìn)行腹部探查術(shù),時(shí)間為2 h,術(shù)中丙泊酚維持麻醉,并給予吸氧支持，術(shù)后腹腔注射頭抱，預(yù)防感染。S組大鼠丙泊酚100 mg/kg麻醉誘導(dǎo),保持大鼠自主呼吸,觀察大鼠呼吸動(dòng)度等生命指標(biāo)，注意保暖。對大鼠進(jìn)行開腹探查手術(shù),丙泊酚維持麻醉2 h,麻醉過程中給予吸氧支持。過程中腹腔注射 PNS10 mg，術(shù)畢腹腔注射頭孢，預(yù)防感染。蘇醒后1 h常規(guī)進(jìn)食飲水。

1.4.3術(shù)后用藥及Morris水迷宮測試術(shù)后前3 d每天給予腹部探查各組大鼠腹部注射頭孢曲松鈉，1次/d，S組腹腔注射PNS 10 mg，連續(xù)1 w。各組大鼠于術(shù)后第3天及第7天進(jìn)行Morris水迷宮測試(包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn))。

1.5海馬NGF、BDNF表達(dá)水平沿大鼠雙耳前連線剪開頭皮,自枕骨大孔掀開頭骨,暴露大腦組織,自大腦中段找到海馬組織，仔細(xì)分離右側(cè)海馬組織，加入300 μl Trizol，勻漿后提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用實(shí)時(shí)定量PCR法測定 NGF和BDNF的表達(dá)。引物序列：NGF正義:5' TGCCAAGGCGCAGCTTTCTATC3'，反義:5'GTTTAGTCCAGTGGGCTTCAGGG3'；BDNF正義:5'CTTCATAGGAGACCCTCCGCAAC3'，反義:5'TCTGCCAAAAAGAGACCACAGCA3'。

1.6海馬病理切片自大腦中段找到海馬組織，仔細(xì)分離左側(cè)海馬組織，洗去血液,置于100 ml/L甲醛溶液中浸泡、固定24 h，脫水、透明、浸蠟、常規(guī)石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)檢查。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠逃逸潛伏期術(shù)后3 d的逃逸潛伏期均明顯增加(P<0.05)。手術(shù)組術(shù)后7 d后逃逸潛伏期均有下降;B組和S組術(shù)后7 d與術(shù)后3 d結(jié)果有顯著差異(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠原平臺穿越次數(shù)與術(shù)前1 d相比，術(shù)后3 d麻醉各組穿臺次數(shù)均明顯減少(P<0.05);術(shù)后7 d與術(shù)后3 d相比,B組和S組的穿臺次數(shù)均增加(P<0.05);B組與S組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

2.3海馬NGF、BDNF表達(dá)水平見表3。術(shù)后3 d，與N組比較，B、P、S組的NGF、BDNF mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與術(shù)后3 d相比，術(shù)后7 d B、S、P組的NGF、BDNF mRNA相對表達(dá)量明顯上升(P<0.05)。

表1　各組大鼠治療前后逃逸潛伏期對比 ± s, n=19,s)

與術(shù)前1 d比較：1)P<0.05;與術(shù)后3 d比較：2)P<0.05；表2同

表2　各組大鼠治療前后原平臺穿越次數(shù)對比 ± s, n=19,次)

表3　各組大鼠術(shù)后NGF、BDNF表達(dá)水平比較

與N組相比：1)P<0.05，與術(shù)后3 d比較：2)P<0.05

2.4海馬病理學(xué)改變N組海馬錐體細(xì)胞排列緊密均勻；B組大鼠排列較緊密,少見固縮的神經(jīng)元;P組大鼠錐體細(xì)胞排列疏松,胞核深染,固縮,胞間距較大;S組大鼠錐體細(xì)胞排列疏松,胞核淡染。見圖1。

圖1　各組大鼠海馬病理學(xué)切片

3討論

POCD臨床表現(xiàn)為:記憶力、語言理解能力、注意力等的損害和社交能力的降低,可在術(shù)后數(shù)天到數(shù)周發(fā)生,也可能持續(xù)長久〔6〕。NGF是一類能促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)分化和存活的活性蛋白質(zhì),在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和正常的生理功能中起著重要作用〔7〕。NGF主要分布于神經(jīng)系統(tǒng),而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中海馬內(nèi)NGF蛋白水平也是整個(gè)腦中最高的，其主要作用是維持神經(jīng)元存活,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育,促進(jìn)神經(jīng)元分化〔8〕。BDNF是一種分泌性蛋白，由人類腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因編碼，作為“神經(jīng)營養(yǎng)因子”家族的成員〔9〕，可出現(xiàn)在大腦和外圍神經(jīng)系統(tǒng)，但BDNF在大腦皮質(zhì)和海馬中有的濃度很高〔10〕。BDNF在基底前腦區(qū)很活躍，這對于學(xué)習(xí)、記憶和高等思維至關(guān)重要。PNS能提高腦皮質(zhì)內(nèi)去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)的含量，提高突觸素(Syp)的表達(dá)，改善癡呆模型的病理損傷和學(xué)習(xí)功能障礙。

本研究結(jié)果表明，丙泊酚麻醉會(huì)導(dǎo)致POCD，通過引起NGF、BDNF表達(dá)下降而發(fā)揮作用。術(shù)后長期使用PNS治療,可明顯促進(jìn)海馬內(nèi)的NGF、BDNF表達(dá),抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,提高學(xué)習(xí)能力和記憶能力,從而顯著改善認(rèn)知功能。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-09-17修回〕

(編輯袁左鳴)