黃芪甲苷灌胃預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

黃芪甲苷灌胃預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

馬小亮王桂敏1

(遼寧醫(yī)學(xué)院研究生院，遼寧錦州121001)

摘要〔〕目的探討黃芪甲苷灌胃預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷(I/R)的保護作用。方法將100只大鼠隨機分為三組，最終90只大鼠造模成功，其中假手術(shù)組29只，模型組30只，干預(yù)組31只。假手術(shù)組與模型組給予普通飼養(yǎng)+生理鹽水(2 ml·kg-1·d-1)灌胃，干預(yù)組給予普通飼養(yǎng)+黃芪甲苷(10 mg·kg-1·d-1)灌胃。造模時，假手術(shù)組大鼠只在冠狀動脈左室支左心耳下緣約0.5 cm處穿線，不結(jié)扎；模型組及干預(yù)組大鼠給予結(jié)扎。于灌注24 h后采用TUNEL法計算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，比較Bax、Bcl-2以及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果三組間AI、Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白比較差異表達(dá)(均P<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較，模型組及干預(yù)組的AI、Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，模型組的AI、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)顯著高于干預(yù)組，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于干預(yù)組(均P<0.05)。結(jié)論在大鼠心肌缺血再灌注過程中存在明顯的細(xì)胞凋亡過程，在此過程中，黃芪甲苷可能通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)、降低Bax的表達(dá)實現(xiàn)其對心肌細(xì)胞的保護作用。

關(guān)鍵詞〔〕心肌缺血；再灌注損傷

中圖分類號〔〕R54〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：王桂敏(1957-)，女，碩士，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療心腦血管及老年病方面的研究。

1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科

第一作者：馬小亮(1984-)，男，碩士，醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療心腦血管及老年病方面的研究。

在心肌缺血的心肌細(xì)胞中，即使重新恢復(fù)血流供應(yīng)，也可能會發(fā)生心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、代謝功能以及電生理方面的損害，這種損害甚至是無法逆轉(zhuǎn)的，這種現(xiàn)象被稱為“心肌缺血再灌注損傷”(I/R)〔1～3〕。因此，如何減輕或者逆轉(zhuǎn)這種損傷成為臨床上的研究重點。大量研究表明黃芪具有顯著的心肌保護作用，而黃芪甲苷作為黃芪中的中藥活性成分，是否也具有相同的功效，其中的生理機制又是如何？本文通過觀察大鼠心功能以及心肌細(xì)胞中Bax、Bcl-2以及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的改變，旨在探討黃芪甲苷對心肌細(xì)胞的保護作用及其機制。

1材料與方法

1.1動物選用清潔級雄性Wistar大鼠100只，體重240～360 g，由南京君科生物工程有限公司提供，實驗動物使用許可證號：XYDS(滬)2013-0025。

1.2材料和試劑黃芪甲苷由上海銳谷生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號：HWJG 2013025。兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Bax、 Bcl-2以及caspase-3多克隆抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、免疫組化試劑盒、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)凋亡試劑盒由武漢博士德生物有限公司提供。

1.3分組適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為三組，假手術(shù)組33只，給予普通飼養(yǎng)生理鹽水2 ml·kg-1·d-1灌胃，2 w后僅在冠狀動脈左室支左心耳下緣進(jìn)行穿線處理，但不結(jié)扎，未造成心肌缺血；模型組34只，普通飼養(yǎng)2 w生理鹽水2 ml·kg-1·d-1灌胃后，大鼠建立心肌I/R模型；干預(yù)組33只，大鼠在心肌I/R模型建立前，給予普通飼養(yǎng)的同時，進(jìn)行黃芪甲苷10 mg·kg-1·d-1灌胃2 w。

1.4大鼠I/R模型制備大鼠心肌I/R模型建立步驟：①麻醉：以5 ml/kg為標(biāo)準(zhǔn)，用10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射；②插管保持呼吸通暢；③動脈插管監(jiān)測心率及平均動脈壓；④在冠狀動脈左室支左心耳下緣0.5 cm處進(jìn)行穿線結(jié)扎；⑤阻斷灌狀血流10 min，將結(jié)扎線解開再灌注1 h。模型復(fù)制以六導(dǎo)心電圖進(jìn)行評判，評判標(biāo)準(zhǔn)如下：①ST端抬高0.5 mV；②結(jié)扎處松開后，ST段下降1/2以上， R波振幅降低；③可見有心律失常或Q波，其中①、②為必要條件。在模型建立時，假手術(shù)組有4只大鼠在手術(shù)過程中出現(xiàn)呼吸道阻塞死亡，模型組大鼠有4只大鼠模型建立失敗，干預(yù)組有2只大鼠出現(xiàn)心臟驟停死亡，建模成功率為90%。

1.5心肌凋亡情況測定①將取得的心肌組織于4%的多聚甲醛中固定、脫水、浸蠟包埋；②切片并脫蠟；③磷酸鹽緩沖液洗滌；④加50 μl TUNEL檢測液；⑤30℃下避光孵育1 h；⑥磷酸鹽再次沖洗；⑦熒光顯微鏡下計數(shù)。凋亡指數(shù)(AI)計算公式：陽性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6Bax、Bcl-2以及caspase-3測定采用免疫組織化學(xué)SP法：①將相應(yīng)的石蠟切片脫蠟；②室溫下，3%的過氧化氫滅活內(nèi)源性酶；③微波修復(fù)抗原；④蘇木精復(fù)染，脫水后封片鏡檢。以正常兔IgG代替一抗做對照。使用ImagePro Plus Analysis Software 6.0軟件在200倍顯微鏡下測量其吸光度，每張切片取5個視野，計算平均吸光度。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗；單因素方差分析和LSD檢驗。

2結(jié)果

2.1各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果比較于灌注24 h后，用TUNEL法對大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行測定，藍(lán)色為正常細(xì)胞顯示內(nèi)容，棕色為陽性細(xì)胞細(xì)胞核顯示內(nèi)容(如圖1)。將結(jié)果輸入圖像分析軟件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組AI值有顯著性差異(F=12.562，P<0.05)。兩兩比較，模型組AI值〔(10.25±2.65)%〕顯著高于干預(yù)組〔(8.01±1.66)%〕及假手術(shù)組〔(5.31±1.23)%〕，干預(yù)組顯著高于假手術(shù)組(均P<0.05)。

圖1　心肌凋亡圖(×200)

2.2各組大鼠Bax、Bcl-2以及caspase-3平均吸光度比較三組間心肌組織中的Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白表達(dá)具有顯著性差異(F=19.56、21.02、16.98，均P<0.05)；兩兩比較，模型組及干預(yù)組的Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，模型組的Bax、caspase-3蛋白顯著高于干預(yù)組(P<0.05)，模型組Bcl-2蛋白顯著低于干預(yù)組(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠Bax、Bcl-2以及caspase-3

與假手術(shù)組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05

3討論

黃芪甲苷是中藥黃芪中的主要活性物質(zhì)之一，為皂苷類化合物。研究顯示，這種黃芪中的主要成分對缺血性再灌注損傷的心肌細(xì)胞具有較為顯著的保護作用〔4〕。然而其中的具體機制目前尚未明確。

心肌細(xì)胞的死亡方式主要為壞死和細(xì)胞凋亡，所以I/R所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡也在此列。然而細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜的過程，其中多個基因參與到此過程中，其中最受關(guān)注的就是Bcl-2家族，而Bax和Bcl-2作為家族中的主要成員，Bcl-2主要的生理功能是抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命〔5〕。Bax的功能正好與此相反，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，兩者可在細(xì)胞內(nèi)形成異源二聚體——Bax-Bcl-2，異源Bax-Bcl-2較為穩(wěn)定，無誘導(dǎo)凋亡作用，而當(dāng)Bax較Bcl-2升高時，則合成同源Bax-Bcl-2，可誘導(dǎo)凋亡〔6〕。caspase-3作為caspase家族中的一員，同樣在細(xì)胞凋亡過程中扮演重要角色，其誘導(dǎo)過程為蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，首先激活caspase，然后逐級活化細(xì)胞凋亡蛋白，最后激活執(zhí)行型caspase，最終作用于底物蛋白，使蛋白分解導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔7，8〕。

本研究結(jié)果提示黃芪甲苷對大鼠I/R的保護作用比較明顯；另外提示在I/R大鼠心肌細(xì)胞中存在較多的細(xì)胞凋亡和抗凋亡誘導(dǎo)因子，而黃芪甲苷對心肌細(xì)胞的保護作用可能同上調(diào)Bcl-2的表達(dá)、同時降低Bax的表達(dá)來實現(xiàn)。但本研究尚處于初級階段，尚需更加深入系統(tǒng)的研究。

4參考文獻(xiàn)

1Tian Y,Zhang W,Xia D,etal.Postconditioning inhibits myocardial apoptosis during prolonged reperfusion via a JAK2-STAT3-Bcl-2 pathway〔J〕.J Biomed Sci,2011;18(1):53.

2賀中民,謝艷華,王四旺,等.燈延顆粒對結(jié)扎冠狀動脈所致大鼠心肌缺血的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010;10(4):625-9,封3.

3Jennings RB.Historical perspective on the pathology of myocardial ischemia/reperflusion injury〔J〕.Circ Res,2013;113(4):428-38.

4Zhang WD,Chen H,Zhang C,etal.Astragaloside Ⅳ from Astragalus membranaceus shows cardioprotection during myocardial ischemia in vivo and in vitro〔J〕.Planta Med,2006;72(1):4-8.

5劉展,張明亮,張俐,等.胃癌及癌前病變中的細(xì)胞凋亡與Bcl-蛋白、P糖蛋白的表達(dá)及相關(guān)性研究〔J〕.南華大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2002;30(2):1.

6Gobe G,Rubin M,Williams G,etal.Apoptosis and expression of Bcl-2,Bcl-XL,and Bax in renal cell carcinomas〔J〕.Cancer Invest,2002;20(3):324-32.

7Doonan F,Cotter TG.Detection of DNA fragmentation inretinal apoptosis by TUNEL〔J〕.Methods Mol Biol,2013;935(2):207-13.

8Brot S,Rogemond V,Perrot V,etal.CRMP5 interacts with tubulin toinhibit neurite outgrowth,therebv modulating the function of CRMP2〔J〕.J Neurosci,2010;30(32):10639-54.

〔2015-04-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)