二甲雙胍對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

二甲雙胍對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

楊迪顧俊菲葉山東

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽合肥230001)

摘要〔〕目的探討不同濃度二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響及其對(duì)糖尿病腎病(DN)的保護(hù)機(jī)制。方法將大鼠腎小球系膜細(xì)胞分別培養(yǎng)在正常對(duì)照組(NC組)、高糖(HG組)及高糖+不同濃度二甲雙胍組。48 h后，比色法測(cè)定細(xì)胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量，RT-PCR方法測(cè)定細(xì)胞p22phox和p47phox mRNA表達(dá)情況。結(jié)果與NC組比較，HG組MCs p22phox和p47phox mRNA表達(dá)明顯增加，上清液SOD活力明顯降低，MDA含量明顯增高(P<0.05)。二甲雙胍干預(yù)高糖組MCs p22phox和p47phox mRNA表達(dá)明顯低于HG組(P<0.05)，且二甲雙胍濃度越高，MCs p22phox和p47phox mRNA表達(dá)越低。結(jié)論二甲雙胍可降低高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞3-磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)氧化酶表達(dá)水平，從而起到減輕氧化應(yīng)激的作用，該作用在二甲雙胍治療糖尿病時(shí)表現(xiàn)為對(duì)腎臟的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕二甲雙胍；系膜細(xì)胞；氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào)〔〕R587〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金(No.11040606M161)；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(No.KJ2011A157)

通訊作者：葉山東(1964-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥研究。

第一作者：楊迪(1990-)，女，在讀碩士，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥研究。

糖尿病腎病(DN)為糖尿病患者最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚不完全明確。近年來(lái)，研究證實(shí)高血糖引起的氧化應(yīng)激是DN的重要發(fā)病機(jī)制之一。二甲雙胍作為治療糖尿病的一線藥物，已在臨床廣泛使用，一些研究證實(shí)其對(duì)糖尿病患者腎臟存在降糖外的保護(hù)作用〔1〕，部分可能與其減輕氧化應(yīng)激有關(guān)，但其減輕氧化應(yīng)激的效果并未得到證實(shí)，同時(shí)其機(jī)制也尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用不同濃度二甲雙胍干預(yù)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)，觀察不同濃度二甲雙胍下大鼠細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的區(qū)別，探討二甲雙胍對(duì)腎臟作用的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料大鼠GMCs由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供；DMEM培培養(yǎng)液由上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)，雙抗購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清(FBS)由美國(guó)Life Technologies生產(chǎn)，胰酶消化液購(gòu)自碧云天生物公司；二甲雙胍購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，脂質(zhì)氧化(MDA)試劑盒及超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒由美國(guó)羅氏公司生產(chǎn)，RNA抽提試劑(Trizol)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒由美國(guó)Life Technologies生產(chǎn)，PCR引物由北京優(yōu)博蘭基因技術(shù)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)GMCs進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%FBS與1%雙抗的低糖DMEM液，DMEM液中葡萄糖(Glu)濃度為5.6 mmol/L。將GMCs細(xì)胞置于以上培養(yǎng)液中并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，環(huán)境條件設(shè)定為37℃，5% CO2濃度，并采用胰酶消化。以上細(xì)胞傳代2～3次/w，并選擇4～6代細(xì)胞進(jìn)入分組環(huán)節(jié)。

1.2.2分組與處理將進(jìn)入分組的細(xì)胞采用胰酶處理后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，接種密度控制2×105/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，吸去原有培養(yǎng)液，并采用1%FBS低糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中葡萄糖濃度為5.6 mmol/L，共培養(yǎng)24 h確保選擇細(xì)胞生長(zhǎng)同步化后，進(jìn)行分組處理。將以上細(xì)胞共分為五組，①正常對(duì)照組(NC組)：DMEM液(Glu 5.6 mmol/L)；②高糖組(HG組)：DMEM液(Glu 25 mmol/L)；③二甲雙胍1組(Met 1組)：HG+met(0.5 mmol/L)；④二甲雙胍2組(Met 2組)：HG+met(1.0 mmol/L)；⑤二甲雙胍3組(Met 3組)：HG+met(2.0 mmol/L)，對(duì)于Met1、Met2及Met3三組細(xì)胞采用設(shè)定的二甲雙胍濃度干預(yù)24 h。以上五組細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，吸取各組細(xì)胞上清液及細(xì)胞進(jìn)入檢測(cè)環(huán)節(jié)，對(duì)于檢測(cè)指標(biāo)共設(shè)置6個(gè)重復(fù)組。

1.2.3SOD與MDA含量測(cè)定嚴(yán)格按照對(duì)應(yīng)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并實(shí)施質(zhì)量控制。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)大鼠GMCs p22phox mRNA和p47phox mRNA表達(dá)擴(kuò)增p22phox基因引物序列：上游5′-GACGCTTCACGCAGTGGTACT-3′，下游5′-CACGACCTCATCTGTCACTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為485 bp。擴(kuò)增p47phox基因引物序列：上游5′-CAGAATGTTGCCTGGTTG-3′，下游5′-GTGCCCTCCCTTAGATGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為416 bp。擴(kuò)增3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因引物序列為：上游5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′，下游5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為308 bp。p22phox的PCR反應(yīng)條件：95℃下預(yù)變性3 min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)條件為94℃下變性1 min，63.3℃下退火1 min，并在72℃下延伸1 min，循環(huán)次數(shù)共計(jì)30次，循環(huán)后在72℃下延伸10 min后4℃下保存。p47phox的PCR反應(yīng)條件與p22phox區(qū)別在于退火溫度設(shè)定為58.5℃；GAPDH的PCR反應(yīng)條件為94℃下預(yù)變性3 min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)條件為94℃下變性30 s，52℃下退火1 min，并在72℃下延伸1 min，循環(huán)次數(shù)總計(jì)35次。循環(huán)結(jié)束后于72℃下延伸10 min后于4℃下保存。將以上PCR所得產(chǎn)物取10 μl于2%瓊脂糖凝膠中電泳分析，并采用溴化乙錠染色后拍照，進(jìn)行吸光度掃描。根據(jù)條帶光密度計(jì)算p22phox/GAPDH與p47phox/GAPDH條帶光密度比值，并根據(jù)計(jì)算值計(jì)算各因子基因產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1各組GMCs上清液中SOD活性和MDA水平的影響MDA含量HG組〔(11.39±0.41)nmol/ml〕顯著高于NC組〔(5.59±0.42)nmol/ml〕；各二甲雙胍組均較HG組含量降低，但均高于NC組(P<0.05);Met1組含量〔(8.79±0.44)nmol/ml〕高于Met2組〔(7.48±0.56)nmol/ml〕以及Met3組〔(7.20±0.37)nmol/ml〕(P<0.05)，但Met2組與Met3組MDA含量無(wú)明顯差異。與NC組〔(12.22±0.75)U/ml〕比較，HG組SOD活性〔(7.66±0.55)U/ml〕明顯下降(P<0.05)，各二甲雙胍組經(jīng)不同濃度二甲雙胍干預(yù)，SOD活性較HG組不同程度升高(P<0.05)；其中，Met1組〔(9.00±0.69)U/ml〕與Met2組〔(9.08±1.35)U/ml〕SOD活性無(wú)明顯差異，但Met1與Met3組〔(10.63±0.34)U/ml〕、Met2組與Met3組SOD活性均存在差異(P<0.05)。

2.2各組GMCs p22phox、p47phox mRNA表達(dá)水平經(jīng)高糖刺激后，HG組p22phox、p47phox mRNA表達(dá)水平(1.22±0.02，0.81±0.02)明顯高于NC組(0.63±0.02，0.58±0.27)(P<0.01)；Met1組(1.09±0.01，0.71±0.18)、Met2組(0.90±0.01，0.65±0.02)及Met3組(0.67±0.02，0.60±0.02)p22phox、p47phox mRNA表達(dá)水平均低于HG組(P<0.05)，但仍高于NC組。Met1與Met2組，Met1與Met3組，Met2與Met3組之間p22phox和p47phox mRNA表達(dá)均有差異(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1　各組GMCs p22phox、p47phox mRNA相對(duì)表達(dá)量

3討論

DN是由糖尿病引起的微血管病變，可導(dǎo)致終末期腎病，是糖尿病患者主要致死原因之一。其病理變化早期主要為腎小球肥大，腎小球基底膜與系膜區(qū)增厚增寬。后期疾病進(jìn)展，腎小球基底膜增厚呈彌漫性并伴隨基質(zhì)增生，形成結(jié)節(jié)，最終導(dǎo)致腎小球硬化。DN發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前普遍認(rèn)為與高血糖引起的代謝紊亂、遺傳環(huán)境因素、血流動(dòng)力學(xué)改變等有一定關(guān)系，其中高血糖血癥介導(dǎo)的氧化應(yīng)激起著關(guān)鍵作用〔2，3〕。

機(jī)體中存在氧化與抗氧化雙重作用。氧化應(yīng)激產(chǎn)物包括活性氧自由基(ROS)及活性氮自由基(RNS)兩類，而抗氧化系統(tǒng)主要包括酶抗氧化系統(tǒng)及非酶抗氧化系統(tǒng)兩類。在酶抗氧化系統(tǒng)中，SOD可催化超氧化物歧化生成氧氣和過(guò)氧化氫，在細(xì)胞抗氧化機(jī)制中發(fā)揮重要作用〔4〕。MDA作為自由基作用于脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的終末產(chǎn)物，可間接反映機(jī)體氧化損傷水平。p47phox和p22phox為GADPH氧化酶亞單位，是調(diào)控ROS生成的酶的主要來(lái)源〔5〕。糖尿病患者中普遍存在氧化應(yīng)激產(chǎn)物增多及抗氧化能力降低，其直接表現(xiàn)是大量氧化中間產(chǎn)物的增多及清除減少，最終導(dǎo)致組織氧化損傷〔6〕。

二甲雙胍是被廣泛推薦為治療糖尿病的一線首選藥物，近年來(lái)一些臨床研究顯示二甲雙胍可減輕患者體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)〔7〕。Alhaider等〔8〕研究報(bào)告二甲雙胍可通過(guò)上調(diào)CAT等氧化因子的mRNA水平的表達(dá)來(lái)減少氧化應(yīng)激，保護(hù)DN大鼠的腎臟，且這種保護(hù)作用獨(dú)立于降糖之外。本試驗(yàn)提示高糖培養(yǎng)的GMCs存在氧化應(yīng)激。經(jīng)過(guò)不同濃度二甲雙胍干預(yù)后，高糖刺激培養(yǎng)下增強(qiáng)的GMCs p22phox和p47phox mRNA表達(dá)明顯降低，細(xì)胞培養(yǎng)上清液SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低且呈一定的濃度依賴性。但二甲雙胍減輕GMCs氧化應(yīng)激的機(jī)制尚不十分明確，可能與其通過(guò)激活A(yù)MPK-FOXO3信號(hào)通路誘導(dǎo)抗硫氧還原蛋白表達(dá)〔9〕，在脂肪組織中促解偶聯(lián)蛋白2表達(dá)有關(guān)〔10〕。Forbes等〔11〕報(bào)道二甲雙胍還可通過(guò)降低腎臟組織的非酶糖基化作用，從而降低腎小球氧化應(yīng)激損傷。本研究顯示二甲雙胍可降低高糖介導(dǎo)的大鼠GMCs p22phox和p47phox表達(dá)，從而起到調(diào)控活性氧自由基生成的效果，減輕高糖血癥引起的氧化應(yīng)激損傷，并表現(xiàn)出二甲雙胍使用劑量與兩種基因mRNA表達(dá)水平負(fù)相關(guān)性，因此推測(cè)可能該效應(yīng)為二甲雙胍對(duì)DN腎臟保護(hù)作用的機(jī)制。

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〔2015-04-19修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)