苦參堿對胃癌SGC7901/DDP細胞耐藥相關miRNA表達的影響和靶點分析

苦參堿對胃癌SGC7901/DDP細胞耐藥相關miRNA表達的影響和靶點分析

李海龍1陳兆峰2劉敏2楊雅麗1王晶1吳紅彥1

(甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅蘭州730000)

摘要〔〕目的探討苦參堿對化療藥物的增敏作用和機制。方法以非毒性劑量的苦參堿聯(lián)合長春新堿、阿霉素、5-氟尿嘧啶干預胃癌SGC7901/DDP細胞，觀察苦參堿對胃癌SGC7901/DDP細胞耐藥性的增敏作用；采用實時熒光定量PCR觀察苦參堿干預后耐藥相關miRNA的表達，并應用生物信息學方法預測和分析相關miRNA的靶基因和信號通路，應用GO分析方法進行了靶基因的功能注釋。結果苦參堿可以增強胃癌SGC-7901/DDP細胞對化療藥物的敏感性，逆轉耐藥；苦參堿可以劑量依賴性上調耐藥相關mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a的表達，生物信息學方法預測和分析了其靶基因和相關信號通路，并篩選出耐藥相關miRNA靶向調控的耐藥基因和DNA修復基因，為苦參堿克服胃癌化療多藥耐藥提供了靶點。結論苦參堿可以增強胃癌SGC-7901/DDP細胞對化療藥物的敏感性；其作用可能與苦參堿可以上調耐藥相關mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a的表達，并通過miRNA靶向調控的耐藥基因和DNA修復基因有關。

關鍵詞〔〕苦參堿；SGC7901/DDP；腫瘤多藥耐藥；miRNA

中圖分類號〔〕R73-36+1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：甘肅省中藥藥理與毒理實驗室開放課題(No.ZDSYS-KJ-2012-003)；中醫(yī)學院中青年項目(BH2010-071)

1甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室甘肅省中藥新產品創(chuàng)制工程實驗室甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉化重點實驗室

2蘭州大學第一醫(yī)院消化內科

第一作者：李海龍(1975-)，男，副教授，主要從事中藥抗腫瘤藥理研究。

多藥耐藥性(MDR)是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產生抗藥性的同時，對結構和作用機制不同的多種抗腫瘤藥物亦產生交叉耐藥現(xiàn)象，從而大大降低了抗腫瘤藥物的療效?？鄥A是豆科槐屬植物苦參和廣豆根中分離出來的一種生物堿，具有抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡以及誘導腫瘤細胞分化的作用等多方面的藥理作用和功效，其中有研究表明氧化苦參堿或苦參堿可以逆轉多種腫瘤細胞的耐藥性〔1～4〕。近來發(fā)現(xiàn)有microRNA通過調節(jié)一些相關的基因參與了腫瘤細胞耐藥現(xiàn)象的發(fā)生〔5〕。本研究分析苦參堿調節(jié)胃癌SGC-7901/DDP對化療藥物敏感作用及其對胃癌SGC7901/DDP細胞耐藥相關miRNA表達的影響和生物信息學。

1材料與方法

1.1材料RPMI1640 (GIBCO公司)，小牛血清(蘭州榮曄生物公司)、四唑鹽(MTT，Sigma公司)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)、苦參堿(陜西寶雞方晟生物公司)、順鉑(DDP)、阿霉素(ADM，深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：1104E1)、長春新堿(VCR，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：110101)、5-氟尿嘧啶(5-FU，旭東海普，批號：110305)、SGC7901/DDP購自上海博谷生物公司。

1.2細胞培養(yǎng)及實驗分組SGC7901/DDP細胞接種于含10% 小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在培養(yǎng)體系中加入終濃度為1 mg/L的DDP以維持耐藥性，置37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液傳代培養(yǎng)。實驗前無藥培養(yǎng)2 w。以SGC7901/DDP為實驗模型加不同濃度苦參堿為實驗組，每組各設3個平行實驗。

1.3MTT法檢測細胞藥敏性及對化療藥物的增敏作用取對數(shù)生長期的兩種細胞，用0.25%胰酶消化，用RPMI-1640培養(yǎng)液制備成單細胞懸液，計數(shù)后接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細胞數(shù)為1×104個，體積為200 μl。細胞培養(yǎng)過夜，使細胞處于對數(shù)生長期。在96孔板中加入非細胞毒性藥物劑量的苦參堿，參照VCR、ADM及5-FU的血漿高峰濃度(VCR 0.5 μg/ml，ADM 0.4 μg/ml，5-FU 10 μg/ml)加入不同濃度(0.01，0.1，1，10，100×PPC)的各化療藥物。于37℃，5%CO2下培養(yǎng)48 h，每孔加入新配置的MTT 20 μl，37℃下再培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄去上清液；每孔加入DMSO150 μl，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇570 nm波長在酶標儀上檢測，取每3個平行孔A570 nm值的平均數(shù)，采用常規(guī)MTT法，計算抑制率，確定抑制率≤10%的藥物濃度為該藥的非細胞毒性濃度。

1.4實時熒光定量PCR法檢測胃癌SGC7901/DDP細胞耐藥相關miRNA的表達采用TRIzol試劑從細胞中提取總RNA，檢測RNA的含量和純度(A260 nm/A280 nm=1.8～2.0)。以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性(28 S和18 S RNA條帶比值≥2.0)。用1 μg細胞總RNA進行miRNA逆轉錄，以U6 snRNA 作為內參，通過2-ΔΔCT法計算各濃度苦參堿SGC7901/DDP 細胞與SGC7901/DDP細胞之間目標miRNA表達水平的差異(以比值表示，SGC7901/DDP細胞的目標 miRNA 表達水平設為1)。其中ΔΔCt=ΔCt干預后SGC7901/DDP-ΔCt SGC7901/DDP；ΔCt=Ct miRNA-Ct U6。Ct 為反應的實時熒光強度達到設定的閾值時所經過的擴增循環(huán)數(shù)，此時擴增是呈對數(shù)期增長。實驗重復三次，U6、mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a特異性引物由基因復能生物公司設計合。

1.5miRNA靶基因的生物信息學分析對mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a的靶基因使用mirfocus網站的生物信息學軟件進行預測分析，信號通路分析采用KEGG Pathway、Biocarta Pathway軟件富集分析，并對靶基因進行了基因功能注釋即GO分析，檢驗水準為P<0.05。

1.6miRNA靶向調控的耐藥基因的生物信息學分析應用以mirWALK網站的生物信息學分析軟件miRanda、miRDB、miRWalk、RNA22、TargetScan檢索篩選靶向調控耐藥基因：ABCB1 (MDR1)，ABCC1 (MRP1)，ABCC2 (MRP2)，ABCC3 (MRP3)，ABCC5 (MRP5)，ABCG2 (BCRP)，BAX，BCL2，BCL2L1 (BCL-X)，MVP (LRP)，RB1，TOP1，TOP2A，TOP2B，TP53，和DNA修復基因APC，ATM，BRCA1，BRCA2，ERCC3，MSH2，XPA，XPC的miRNA，其中包含生物信息學預測的miRNA靶基因，也包括已經生物學驗證的miRNA靶基因，以檢索出的結果至少需要三個軟件分析支持才列為篩選結果。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS17.00軟件行方差分析和t檢驗。

2結果

2.1苦參堿對胃癌SGC7901/DDP耐藥細胞增殖的影響苦參堿體外處理SGC7901/DDP耐藥細胞后，SGC7901/DDP細胞增殖被明顯抑制。隨著苦參堿劑量的增加抑制作用逐漸增強。當0.5，1.0，1.5和2.0 mg/L的苦參堿作用SGC7901/DDP細胞24 h時，SGC7901/DDP細胞增殖抑制率分別達到(8.78±1.15)%、(27.65±3.68)%、(48.98±5.24)%和(74.35±6.50) %。

2.2苦參堿對UCR、ADM和5-FU干預SGC7901/DDP耐藥細胞的增敏作用0.5 mg/L的苦參堿聯(lián)合不同濃度(0.01，0.1，1，10，100倍PPC)的VCR、ADM和5-FU干預后，對SGC7901/DDP耐藥細胞的抑制率明顯高于單純以同濃度的VCR、ADM和5-FU干預。見表1。

2.3苦參堿對SGC7901/DDP細胞耐藥相關miRNA表達的影響不同濃度的氧化苦參堿干預SGC7901/DDP細胞后，mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a的表達均出現(xiàn)了明顯的劑量依賴性上調表達(P<0.01)。見表2。

2.4miRNA靶向調控的耐藥基因的生物信息學分析分析結果見表3、圖1。

表1　苦參堿聯(lián)合VCR、ADM和5-FU干預SGC7901/DDP耐藥細胞的增殖抑制率

與單純同濃度VCR、ADM、5-FU比較：1)P<0.01

表2　苦參堿對SGC7901/DDP細胞耐藥相關miRNA

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.001

表3　SGC7901/DDP細胞耐藥相關miRNA的靶向調控耐藥

圖1　miRNA與靶向調控的耐藥基因的network

3討論

腫瘤多藥耐藥是臨床化療失敗的主要原因之一，但其耐藥性機制至今尚未完全闡明。MicroRNA(miRNA)是一類長度為18～25個核糖核苷酸的非編碼內源性單鏈小分子RNA，由基因組DNA編碼，與靶標基因 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)不完全互補結合，進而抑制翻譯；或與靶標基因 3′UTR 完全互補結合，最后導致靶 mRNA 的降解，從而對基因進行轉錄后表達的調控〔6〕。microRNA在多種生理和病理過程中發(fā)揮作用，大約50%的microRNA位于腫瘤相關的基因組區(qū)〔7〕。miRNA對多基因表達的調控具有高效性和特異性，對靶基因的異常調控可能構成腫瘤耐藥機制，是腫瘤耐藥復雜性調控的重要構成部分。例如，在胃癌中均發(fā)現(xiàn)一些 microRNA 參與了腫瘤耐藥〔8～10〕。

因此，探討增強DDP、5-FU等化療藥物的敏感性，降低耐藥性對腫瘤化療意義重大，而逆轉DDP、5-FU的miRNA耐藥標志物，是逆轉腫瘤耐藥，增強化療敏感性的重要手段，本研究顯示，苦參堿干預SGC7901/DDP細胞24h后，mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a出現(xiàn)劑量依賴性的升高，生物信息學分析這些miRNA上調之后，所靶向調控的基因有數(shù)百個之多，信號通路涉及數(shù)十個，基因功能分類涉及腫瘤代謝、增殖、耐藥等多各方面，經mirwalk網站的生物信息學軟件檢索并篩選，其靶向調控的耐藥基因有ABCB1 (MDR1)，ABCC1 (MRP1)，ABCC2 (MRP2)，ABCC3 (MRP3)，ABCC5 (MRP5)，ABCG2 (BCRP)，BAX，BCL2，BCL2L1 (BCL-X)，MVP (LRP)，RB1，TOP1，TOP2A，TOP2B，TP53；DNA修復基因有APC，ATM，BRCA1，BRCA2，ERCC3，MSH2，XPA，XPC。

陳勇等〔11，12〕使用microRNA 芯片檢測出胃癌DDP耐藥 SGC7901/DDP 細胞及其親本SGC7901之間 microRNA的表達差異，其中microRNA-200c下調超過了兩倍，智慧〔13〕應用microRNA 芯片與對照的SGC-790細胞相比，SGC7901/VCR 細胞中miR-125b表達下調倍數(shù)為2.12倍；Wu等〔14〕用SRB方法分析6個羥喜樹堿(HCPT)耐藥性胃癌細胞株(BGC-823，SGC-7901，MGC-803，HGC-27，NCI-N87和AGS)對羥喜樹堿的敏感性，在耐藥性細胞株中有25種miRNA產生異常，其中miR-200家族和miR-7出現(xiàn)下調表達，轉染 miR-125b模擬物可顯著上調耐藥細胞中miR-125b表達水平，并顯著增加耐藥細胞對化療藥物的敏感性，熒光素酶實驗證實BCL2，MCL1是miR-125b的靶基因；上調microRNA-200c 的表達能顯著增加 SGC7901/DDP細胞在體外對DDP、ADM、5-FU及紫杉醇四種抗腫瘤藥物的敏感性，發(fā)揮化療增敏作用。因此，針對耐藥相關的microRNA，進行過表達或抑制手段，是克服腫瘤耐藥的重要方法，但其缺憾是只能針對單個靶點干預；而運用中藥干預的優(yōu)勢明顯，其針對microRNA多靶點的干預可調控若干耐藥基因表達實現(xiàn)化療增敏和克服耐藥。另外，苦參堿干預 SGC7901/CDDP細胞后，可通過miRNA引起的差異表達的非耐藥靶基因則數(shù)量龐大，所實現(xiàn)的功能調節(jié)也涉及若干方面，尤其對mir-200a、mir-200b的表達影響尤其顯著。

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〔2014-04-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)