蛇床子素通過抑制PI3K/Akt信號通路減輕糖尿病腦病的炎癥反應

蛇床子素通過抑制PI3K/Akt信號通路減輕糖尿病腦病的炎癥反應

毛小元周宏灝劉昭前

(中南大學湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所，湖南長沙410008；中南大學臨床藥理研究所湖南省遺傳藥理學重點實驗室，湖南長沙410078)

摘要〔〕目的探討蛇床子素(OST)對糖尿病腦病的神經保護作用及其分子機制。方法應用水迷宮實驗檢測OST對糖尿病大鼠模型學習記憶的影響；應用試劑盒法檢測不同實驗組海馬中膽堿酯酶(AChE)和膽堿乙酰基轉移酶(ChAT)、炎癥因子(包括NF-κB p65、TNF-α和IL-1β)和caspase-3的活性；應用Western印跡方法檢測檢測不同實驗組海馬中磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表達。結果OST改善了糖尿病大鼠模型的學習記憶能力，降低了糖尿病大鼠模型組海馬中AChE和炎癥因子(包括NF-κB p65、TNF-α和IL-1β)及cascapse-3的活性(P<0.01)，提高了ChAT的活性(P<0.01)，降低了p-Akt蛋白的表達(P<0.01)。同時，當使用LY294002阻斷PI3K后，OST抑制炎癥的作用更為明顯，且進一步下調了p-Akt蛋白的表達。結論OST對糖尿病腦病大鼠模型具有神經保護作用，這種保護作用可能是通過抑制PI3K/Akt信號通路減輕炎癥反應來實現(xiàn)的，其可能成為臨床上緩解糖尿病患者并發(fā)學習記憶障礙的新型治療藥物。

關鍵詞〔〕蛇床子素；糖尿病腦??；神經保護；炎癥；PI3K；Akt；caspase-3

中圖分類號〔〕R587.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(81302750)

第一作者：毛小元(1984-)，男，博士，講師，主要從事神經藥理學和臨床藥理學研究。

Osthole alleviates the inflammation in rats with diabetes-associated cognitive decline via inhibiting PI3K/Akt signaling pathway

MAO Xiao-Yuan, ZHOU Hong-Hao, LIU Zhao-Qian.

Institute of Clinical Pharmacology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan, China; Institute of Clinical Pharmacology, Hunan Key Laboratory of Pharmacogenetics, Central South University, Changsha 410078, Hunan, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the neuroprotective effects of osthole in rats with diabetes-associated cognitive decline (DACD) and potential molecular mechanisms. MethodsThe learning and memory performance were assessed by Morris water maze test; The activities of AChE, ChAT, inflammatory cytokines including NF-κB p65, TNF-α and IL-1β and caspase-3 in the hippocampus were detected by respective commercial kits; Western blot analysis was employed to determine the protein level of phosphor-Akt (p-Akt) in the hippocampus.ResultsOsthole significantly improved learning and memory functions in diabetic groups. Additionally, the activities of AChE and inflammatory cytokines including NF-κB p65, TNF-α and IL-1β and caspase-3 in the hippocampus were all remarkably decreased, while increased ChAT was found in diabetic rats. Furthermore, osthole also diminished the protein expression of p-Akt in diabetic rats.ConclusionsOsthole exerts protective potential against DACD and this neuroprotection is associated with suppressing PI3K/Akt-mediated inflammation in diabetic rats. It is likely to be a novel therapeutic drug for the treatment of diabetic patients with cognitive deficits in clinical practice.

【Key words】Osthole; Diabetes-associated cognitive decline; Neuroprotection; Inflammation; PI3K; Akt; caspase-3

糖尿病腦病是糖尿病發(fā)生過程中的主要并發(fā)癥，表現(xiàn)為學習記憶功能減退，同時伴有大腦結構及神經生理等方面的病理性改變〔1，2〕。糖尿病患者發(fā)生學習記憶障礙的概率是普通健康人群的兩倍〔3〕。目前糖尿病腦病的發(fā)病機制尚不十分明確，但是近年來發(fā)現(xiàn)高血糖可能是糖尿病腦病發(fā)生的關鍵因素，通過對血糖的控制可以顯著改善糖尿病并發(fā)的認知功能障礙〔4〕。蛇床子素(OST)具有抗炎、抗氧化及延緩細胞衰老等作用〔5，6〕；但是否對糖尿病腦病具有保護作用，目前尚不清楚。本研究旨在探索OST對糖尿病大鼠模型的神經保護作用從而為治療糖尿病腦病提供理論基礎。

1材料與方法

1.1動物、主要試劑和儀器成年3月齡雄性Wistar大鼠80只，體重210～230 g，由中南大學實驗動物部提供。STZ，LY294002和OST(美國Sigma公司)。鹽酸多奈哌齊片(中國衛(wèi)材藥業(yè))。糖過氧化物酶診斷試劑盒(印度Span Diagnostic公司)。膽堿酯酶(AChE)和膽堿乙?；D移酶(ChAT)活性檢測試劑盒(南京建成生物技術研究所)。caspase-3活性檢測試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所)。小鼠抗大鼠p-Akt和Ak抗體(美國Santa Cruz公司)。DYY-5型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器)，Centrifuge 5810R低溫高速離心機(德國Eppendorf)，化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國BioRad公司)。

1.2糖尿病大鼠模型制作及藥物干預Wistar大鼠適應1 w后，隨機選取72只Wistar大鼠給予STZ(0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液pH4.5稀釋)65 mg/kg一次性腹腔注射，其余8只大鼠給予等劑量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射作為對照組。給予STZ 72 h之后，使用糖過氧化物酶診斷試劑盒檢測血糖，快速血糖濃度大于250 mg/dl認為糖尿病模型制作成功，可以進行下一步實驗。實驗分為10組，每組8只：(1)對照組(Con)；(2)模型組；(3)低劑量治療組〔OST (1)〕；(4)中劑量治療組〔OST (10)〕；(5)高劑量治療組〔OST(50)〕；(6)陽性對照組(Don)；(7)低劑量OST聯(lián)合PI3K抑制劑組〔OST(1)+LY294002〕；(8)中劑量聯(lián)合PI3K抑制劑組〔OST(10)+LY294002〕；(9)高劑量聯(lián)合PI3K抑制劑組〔OST(50)+LY294002)〕；(10)模型給予PI3K抑制劑組。其中模型組中給予等量的生理鹽水作為對照，OST以腹腔注射方式分別按照1、10和50 mg/kg給藥，1次/d，連續(xù)給藥5 w;PI3K抑制劑LY294002在OST最后一次給藥時進行腹腔注射，給藥濃度為50 mmol/L，多奈哌齊在實驗結束前21 d開始腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)給藥21 d。各組動物每周測體重和血糖。給藥結束后，進行后續(xù)的水迷宮實驗。

1.3水迷宮實驗參照以前的實驗方法采用Morris水迷宮實驗考察各組實驗動物的空間學習記憶能力〔7〕。實驗周期共5 d。第1天將大鼠放入水中自由游泳2 min，水迷宮里未放平臺。第2～4天為定位航行實驗，記錄各組實驗動物的逃逸潛伏期(找到平臺所需的時間)。第5天為空間探索實驗，記錄各組實驗動物在60 s內穿梭平臺的次數(shù)和于平臺所在象限內(目標象限)探索時間。

1.4AChE和ChAT活性測定水迷宮實驗結束后，各組實驗動物在麻醉狀態(tài)下斷頭迅速剝離海馬，參照試劑盒說明書測定各組實驗動物的AChE和ChAT活性。

1.5炎癥因子的活性測定各組實驗動物剝離海馬后，按照試劑盒說明書檢測炎癥相關因子(NF-κB p65、TNF-α和IL-1β)的活性。

1.6Western印跡實驗各組實驗動物于麻醉狀態(tài)下斷頭迅速剝離海馬，加入預冷的500 μl RIPA裂解液同時加入5 μl PMSF，超聲勻漿后低溫高速離心(4℃，12 000 r/min，20 min)，取上清后，BCA法進行蛋白定量。按照50 μg蛋白的量進行電泳(10% SDS-PAGE凝膠)，濃縮膠為120 V，分離膠為80 V。轉印至NC膜(200 mA，1.5 h)，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入p-Akt一抗(1∶300)或Akt一抗(1∶300)4℃孵育過夜，次日加入相應的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。ECL化學發(fā)光法顯色，結果經化學發(fā)光成像系統(tǒng)采集，測定灰度值。

1.7caspase-3活性測定各組實驗動物于麻醉狀態(tài)下斷頭迅速剝離海馬，按照試劑盒說明書測定caspase-3的活性。

2結果

2.1OST改善了糖尿病大鼠模型的體重和血糖給予OST治療5 w后，與Con組比較，STZ誘導的糖尿病大鼠模型體重明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。使用不同劑量的OST治療5 w后，這種體重減少的現(xiàn)象得到明顯逆轉(P<0.01)。與此同時，相比于Con組，糖尿病大鼠模型的血糖顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而OST顯著降低了糖尿病大鼠的血糖濃度，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。OST改善糖尿病大鼠模型的體重和血糖的作用與陽性對照藥多奈哌齊的作用非常相似。見表1。

表1　OST對糖尿病大鼠體重、血糖及空間探索實驗的影響 ± s， n=8)

與Con組比較：1)P<0.01，與模型組比較：2)P<0.01，下表同

2.2OST改善了糖尿病大鼠模型的學習記憶能力糖尿病大鼠模型在第1天至第4天實驗中，逃逸潛伏期均比Con組明顯增加(P<0.01)；同時，在第5天的空間探索實驗時，模型組中穿梭平臺的次數(shù)和在目標象限中探索的時間均比Con組顯著縮短(P<0.01)。而使用不同劑量的OST(1，10和50 mg/kg)顯著減少了逃逸潛伏期，增加了穿梭次數(shù)和在目標象限中探索的時間(P<0.01)，且50 mg/kg OST改善糖尿病大鼠模型的學習記憶作用與陽性對照藥多奈哌齊的作用非常相似。見圖1，表1。

圖1　OST對糖尿病大鼠模型逃逸潛伏期的影響

2.3OST改變了糖尿病大鼠模型海馬中AChE和ChAT的活性DM組AChE的活性顯著高于Con組(P<0.01)，而ChAT的活性卻顯著低于正常組(P<0.01)。不同劑量(1、10和50 mg/kg)OST干預后，海馬中AChE的活性顯著降低(P<0.01)，同時ChAT的活性顯著增高(P<0.01)，且50 mg/kg OST改變糖尿病大鼠模型海馬中AChE和ChAT活性的作用與陽性對照藥多奈哌齊的作用非常相似。見表2。

表2　各組AchE及ChAT活性比較

2.4OST抑制了糖尿病大鼠模型海馬中炎癥因子的活性DM組炎癥因子(包括p65 of NFκB，TNF-α和IL-1β)的活性顯著高于Con組(P<0.01)。而使用不同劑量(1、10和50 mg/kg)的OST能夠顯著抑制DM組中炎癥因子的活性(P<0.01)，且這種抑制作用與陽性對照藥多奈哌齊的作用非常相似。此外，使用不同劑量的OST與LY294002聯(lián)合干預后，與單獨使用OST相比較，炎癥因子的活性進一步降低(P<0.01)；同時發(fā)現(xiàn)，高劑量(50 mg/kg)OST與LY294002聯(lián)合干預后，抑制海馬中炎癥因子活性的作用最明顯(P<0.01)。見表3。

表3　各組炎癥相關因子水平比較 ± s, n=8)

與Con組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與Don組比較：3)P<0.01，下表同

2.5各組p-Akt相對表達量及caspase-3水平比較糖尿病模型大鼠海馬中p-Akt蛋白表達、caspase-3的活性顯著高于Con組(P<0.01)。不同劑量OST(1、10和50 mg/kg)顯著降低了DM組中p-Akt的蛋白表達，并抑制了caspase-3的活性(P<0.01)。且50 mg/kg OST對糖尿病大鼠模型海馬中p-Akt蛋白、caspase-3活性的改變與陽性對照藥多奈哌齊的作用非常相似。使用不同劑量的OST與LY294002聯(lián)合干預后，與單獨使用OST干預相比較，p-Akt蛋白的表達顯著降低(P<0.01)；高劑量(50 mg/kg)OST與LY294002聯(lián)合干預后，降低海馬中p-Akt蛋白的表達最為明顯(P<0.01)。在所有實驗組中，海馬中總Akt蛋白的表達沒有任何影響。見表4。

表4　各組p-Akt相對表達量及caspase-3水平比較

3討論

高血糖可能是糖尿病腦病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素〔6〕。因此，通過對血糖的控制，可能對于減輕糖尿病并發(fā)學習記憶障礙具有十分重要的意義。本研究表明OST具有降糖作用，能夠提高糖尿病大鼠模型的學習記憶能力。OST能夠增強東莨菪堿引起的學習記憶障礙〔7〕。

以往有證據(jù)表明，膽堿能神經元功能異常與糖尿病并發(fā)學習記憶障礙的發(fā)生密切相關，即膽堿能神經元中乙酰膽堿含量的降低能夠促使糖尿病腦病的發(fā)生〔8〕。AChE和ChAT是膽堿能神經元中兩種關鍵酶，其中AChE分解乙酰膽堿，降低乙酰膽堿的含量，而ChAT能夠合成乙酰膽堿，提高乙酰膽堿的含量，它們在學習記憶的調節(jié)中起著至關重要的作用。筆者的研究結果發(fā)現(xiàn)，OST能夠顯著降低糖尿病大鼠模型海馬中AChE的活性，同時也可以顯著提高海馬中ChAT的含量。

炎癥因子在學習記憶障礙中也發(fā)揮著關鍵作用。大量研究表明，糖尿病腦病的大鼠模型中往往會釋放大量的炎癥因子〔9，10〕。有研究報道，NF-κB p65介導的炎癥反應可以促進糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程〔11〕。筆者的研究結果表明，OST可以顯著抑制糖尿病大鼠模型海馬中的炎癥反應。同時當OST聯(lián)合PI3K的抑制劑LY294002時，OST抑制炎癥反應的作用得到加強。OST還可提高糖尿病大鼠模型海馬中p-Akt蛋白的表達；而聯(lián)合PI3K的抑制劑LY294002時，蛇床子素的這種作用得到逆轉；提示OST抑制糖尿病腦病的炎癥反應可能是通過抑制PI3K/Akt信號通路來實現(xiàn)的。以往有研究表明，PI3K/Akt信號通路與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關〔12～14〕，通過抑制PI3K/Akt通路可以顯著降低炎癥反應的發(fā)生。

4參考文獻

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〔2015-02-17修回〕

(編輯曲莉)