高效液相色譜法同時測定保健食品中11種功效成分

陳毓芳，林海丹，吳宏中，金 夢，宋 陽，梁小茹，謝玉珊，官詠儀

高效液相色譜法同時測定保健食品中11種功效成分

陳毓芳，林海丹，吳宏中，金 夢，宋 陽，梁小茹，謝玉珊，官詠儀

（廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

建立高效液相色譜同時測定保健食品中11 種功效成分的高通量分析方法。樣品前處理采用甲醇-水-磷酸溶液提取，對油脂樣品則采用甲醇-水-磷酸溶液與正己烷液液萃取除脂。采用Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），乙腈-2 g/L辛烷磺酸鈉溶液（加入1 mL磷酸）作為流動相，流速1.0 mL/min，梯度洗脫，用二極管陣列檢測器串聯(lián)熒光檢測器檢測，外標(biāo)法峰面積定量。VB2在0.25～25 mg/L、VB6在0.5～20 mg/L、煙酸、煙酰胺在1～100 mg/L、其余5 種功效成分在0.5～50 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r為0.999 1～1.000 0。在樣品中待測成分含量約0.5、1 倍和2 倍3 個水平的添加回收率為86.4%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%～11.7%。方法的定量限：煙酸、煙酰胺為20 mg/kg，其余9 種功效成分方法的定量限為10 mg/kg。

高效液相色譜法；水溶性維生素；吡啶甲酸鉻；褪黑素；紅景天苷

VB1（硫胺素）、VB2（核黃素）、VB6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）、煙酸、煙酰胺、吡啶甲酸鉻、褪黑素、咖啡因、紅景天苷作為保健食品的功效成分，對多種疾病的預(yù)防治療有重要的輔助作用。這些功效成分在生產(chǎn)中根據(jù)需求的不同，可能單獨(dú)或同時加入到一種保健食品中。如褪黑素經(jīng)常與VB6一起使用，用于治療失眠癥；VB1、VB2、VB6、煙酸、煙酰胺與吡啶甲酸鉻同時存在多種營養(yǎng)素片中，作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑。因此，多種功效成分被同時添加入一種保健食品中的現(xiàn)象較為普遍。但這些物質(zhì)對于人體只能適量使用，缺乏和超量都是有害的，研究建立同時檢測維生素及其他功效成分的多成分同時檢測分析方法顯得尤其重要。

現(xiàn)有的大部分分析方法僅能檢測其中一種或較少幾種功效成分。檢測方法主要有微生物法[1]、熒光分光光度法[2-3]、毛細(xì)管電泳法[4]、液相色譜-質(zhì)譜法[5-6]、液相色譜法[7-23]。其中，液相色譜法應(yīng)用最為廣泛。如高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定保健食品中紅景天苷的含量[7-8]，HPLC法測定保健食品中褪黑素含量[16]，HPLC法測定保健食品中的吡啶甲酸鉻含量[17-23]，HPLC-熒光法測定保健食品中VB2含量[3]，HPLC法同時測定保健食品中幾種水溶性維生素[10-12]，HPLC法測定保健食品中VB6和褪黑素[15]等。方法中能同時檢測的組分較少，比如GB/T 5009.197—2003《保健食品中鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、煙酰胺和咖啡因的測定》[14]只能測定保健食品中的VB1、吡哆醇、煙酸、煙酰胺、咖啡因5 種物質(zhì)。其中，檢測VB1時所用流動相和其他幾種維生素不同，需更換流動相重新進(jìn)樣分析，增加分析時間和檢測費(fèi)用，且只檢測VB6三種組分中的吡哆醇，不能全面準(zhǔn)確地反映VB6的含量。有關(guān)VB1、VB2、VB6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）、煙酸、煙酰胺、吡啶甲酸鉻、褪黑素、咖啡因、紅景天苷11 種功效成分同時測定的文獻(xiàn)至今未見報道。

本實(shí)驗(yàn)參照GB/T 5009.197—2003現(xiàn)有的多組分分析的提取技術(shù)，采用新的液相色譜流動相體系，以及梯度洗脫的方法，二極管陣列檢測器（photo-diode array，PDA）多通道多波長檢測，同時串聯(lián)熒光檢測器（fluorescence detector，F(xiàn)LD），對有熒光的物質(zhì)VB2、VB6（吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛）及褪黑素同時采用FLD多通道多波長檢測，一次進(jìn)樣能同時分析VB1、VB2、VB6（吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛）、煙酸、煙酰胺、咖啡因、吡啶甲酸鉻、褪黑素、紅景天苷11種組分。方法的重復(fù)性好、靈敏度高、成本低、簡單快速，能滿足實(shí)際檢測的需要。

本工作選擇多種維生素片、保健飲料作為代表基質(zhì)復(fù)雜的保健食品樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察不同提取溶劑提取方法對11 種功效成分的提取效率，同時應(yīng)用PDA與FLD串聯(lián)技術(shù)，采用梯度洗脫方法，HPLC法準(zhǔn)確定量檢測11種功效成分：VB1、VB2、VB6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）、煙酸、煙酰胺、吡啶甲酸鉻、褪黑素、咖啡因、紅景天苷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、辛烷磺酸鈉（均為色譜純） 美國Tedia公司；磷酸（分析純） 廣州分析試劑廠；VB1（純度≥99%）、VB2（純度≥98%）、吡哆醇（純度≥98%）、吡哆醛（純度≥99%）、吡哆胺（純度≥98%）、煙酸（純度≥98%）、煙酰胺（純度≥99.5%）、褪黑素（純度≥98%）、吡啶甲酸鉻（純度≥98%）、紅景天苷（純度≥98%） 美國Sigma公司；咖啡因（純度≥99%） 德國DR公司。

吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺、煙酸、煙酰胺、紅景天苷、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 mg/mL）：稱取0.05 g（精確至0.000 1 g）吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺、煙酸、煙酰胺、紅景天苷、咖啡因（經(jīng)80 ℃干燥4 h）標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于50 mL容量瓶中，用水溶解定容。

VB1標(biāo)準(zhǔn)貯備液（500 μg/mL）：稱取相當(dāng)于硫胺素0.05 g（精確至0.000 1 g）的VB1標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶，用0.01 mol/L鹽酸溶液溶解定容；VB2標(biāo)準(zhǔn)貯備液（250 mg/L）：稱取0.025 g（精確至0.000 1 g）的VB2標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用鹽酸（1＋1）溶液2 mL超聲溶解后，立即用水轉(zhuǎn)移并定容至100 mL；褪黑素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 mg/mL）：稱取0.05 g（精確至0.000 1 g）褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于50 mL容量瓶中，用甲醇（1＋1）溶液溶解定容；吡啶甲酸鉻標(biāo)準(zhǔn)貯備液（500 mg/L）：稱取0.025 g（精確至0.000 1 g）吡啶甲酸鉻標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，用甲醇（1＋1）溶液溶解定容，如有少量殘渣，可使用超聲波加速溶解；取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用提取液配成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。流動相A：乙腈；流動相B：稱2 g辛烷磺酸鈉加水至1 L溶解，加入1 mL磷酸，過濾備用。提取液：甲醇-水-磷酸（100∶400∶0.5，V/V）。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC儀（配PDA、FLD和Empower色譜工作站）美國Waters公司；3-16PK離心機(jī) 德國Sigma公司；超聲波振蕩器 德國IKA公司；往復(fù)振蕩器、Mill-Q超純水器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

固相樣品：準(zhǔn)確稱取適量打碎并混合均勻的樣品于50 mL帶刻度離心管中，加入提取液溶解并定容至50 mL，使各待測物的質(zhì)量濃度范圍在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，搖勻，超聲振蕩提取5 min，放往復(fù)振蕩器上振蕩20 min，在4 000 r/min離心5 min，取清液層過0.45 μm濾膜，供HPLC測定。

液體樣品：準(zhǔn)確稱取適量混合均勻的樣品于50 mL帶刻度離心管中，加入提取液溶解并定容至50 mL，使各待測物的質(zhì)量濃度范圍在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，搖勻，超聲振蕩提取5 min，放往復(fù)振蕩器上振蕩20 min后，在4 000 r/min離心5 min，取清液層過0.45 μm濾膜，供HPLC測定。

含油脂樣品：準(zhǔn)確稱取適量打碎并混合均勻的樣品于50 mL帶刻度離心管中，加入提取液溶解并定容至50 mL，使各待測物的質(zhì)量濃度范圍在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，搖勻，加入2 mL正己烷，超聲振蕩提取5 min，放往復(fù)振蕩器上振蕩20 min后，在4 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，加入正己烷重復(fù)萃取1 次，下層清液用提取液定容至50 mL，過0.45 μm濾膜，供HPLC測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）- 2 g/L辛烷磺酸鈉溶液＋1 mL磷酸（B）；梯度洗脫程序：0～5.00 min，3%～10% A；5.00～8.00 min，10%～18% A；8.0～11.0 min，18%～18% A；11.0～18.0 min，18%～34% A；18.0～20.0 min，34%～34% A；20.0～25.0 min，34%～40% A；25.1 min，3% A。流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；PDA檢測波長：200、260 nm。FLD激發(fā)/發(fā)射波長：293 nm/395 nm；462 nm/522 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液的選擇

實(shí)驗(yàn)測定的11 種功效成分的性質(zhì)相差較大。例如，VB1易溶于水，VB2微溶于水，VB6溶于水，在酸性介質(zhì)中穩(wěn)定。褪黑素溶于乙醇，溶于酸水，在水中的溶解度為800 mg/L；咖啡因易溶于稀酸，微溶于乙醚；紅景天苷極易溶于水，易溶于甲醇；吡啶甲酸鉻微溶于水?？疾?1種成分在水或極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑中溶解的性質(zhì)，但在酸性提取液中的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

為了測試待測物質(zhì)的穩(wěn)定性，用甲醇-水-磷酸（100∶400∶0.5，V/V）提取液配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液放置不同時間后進(jìn)行檢測。結(jié)果表明11 種組分都有較好穩(wěn)定性，工作溶液在連續(xù)3 d的檢測中，11種組分含量沒有明顯變化，15 d后10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)液在提取液中吡啶甲酸鉻含量為原值的77.7%，紅景天苷約為75.0%，其余成分的含量變化小于5%，故考慮采用GB/T 5009.197—2003保健食品中鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、煙酰胺和咖啡因的測定方法的提取溶液甲醇-水-磷酸（100∶400∶0.5，V/V）提取。

實(shí)驗(yàn)中考察提取溶液對吡啶甲酸鉻、VB2、吡哆醛、吡哆胺、褪黑素、紅景天苷的提取能力，并比較GB 5413.12—2010《嬰幼兒食品和乳品中VB2的測定》、GB 5413.13—2010《嬰幼兒食品和乳品中VB6的測定》、GB/T 5009.195—2003《保健食品中吡啶甲酸鉻含量的測定》、GB/T 5009.170—2003《保健食品中褪黑素含量的測定》及保健食品檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范（2003年版）中保健食品中紅景天苷含量的測定的提取和檢測。采用各自方法中所用的提取溶液分別對樣品中VB2、吡哆醛、吡哆胺、吡啶甲酸鉻、褪黑素、紅景天提取檢測，以樣品測得值作為考察指標(biāo)。不同提取溶劑及檢測方法結(jié)果比較見表1。

表 1 保健食品中6 種功能成分的提取溶液比較（n=6）Table 1 Comparison of different extraction solvents for 6 functional components in health foods (n= 6)

表1表明，此提取溶液提取VB2、吡哆醛、吡哆胺、吡啶甲酸鉻、褪黑素、紅景天苷的效果與國標(biāo)及保健食品檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范的檢測方法沒有顯著性差異，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范：食品理化檢測的檢測要求》，表明甲醇-水-磷酸（100∶400∶0.5，V/V）提取溶液適合保健食品中VB2、吡哆醛、吡哆胺、吡啶甲酸鉻、褪黑素、紅景天苷的提取。

2.2 超聲時間的選擇

雖然GB/T 5009.197—2003采用液相色譜法測定保健食品中的VB1、吡哆醇、煙酸、煙酰胺、咖啡因5 種物質(zhì)時選擇超聲5 min，但考慮增加了6 種性質(zhì)有差異的物質(zhì)，為了確保提取完全，實(shí)驗(yàn)考察了超聲波時間對待測組分溶解效率的影響，分別以5、10、15、20 min 4 個超聲時間測試，以樣品測得值作指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)表明超聲5 min后，測得值幾乎不變。結(jié)果表明：5 min提取時間已滿足檢測需要，故仍選擇5 min超聲時間。

2.3 脫脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究含脂類物質(zhì)中提取效率，在樣液中加入正已烷，進(jìn)行脫脂實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，對于有些含脂類物質(zhì)，在使用正已烷脫脂后，VB2的測得值增加，更加接近國標(biāo)值，而其他成分影響甚微。實(shí)驗(yàn)表明，正已烷能更好地溶解和分散脂類物質(zhì)，從而使VB2溶出更完全。

2.4 色譜條件的優(yōu)化結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)考察流動相的組成、pH值、梯度洗脫條件，以及Cloversil C18、Discovery C18、Ecosil C18、Agilent HCC18、Agilent TC-C18等不同的色譜柱對11 種組分的保留行為和分離度的影響。實(shí)驗(yàn)表明采用Agilent TC-C18，乙腈-2 g/L辛烷磺酸鈉溶液（pH （2.1±0.1））梯度洗脫得到較好地分離。水相中加入磷酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明隨著酸度的增加，色譜峰形和分離度得到改善，當(dāng)調(diào)至pH值不高于2.3時峰形和分離度理想，綜合考慮柱子對酸度的耐受性和酸度對待測物響應(yīng)值的影響，因此采用乙腈-2 g/L辛烷磺酸鈉溶液（pH 2.1）作為流動相，既保護(hù)色譜柱又獲得好的分離效果。11 種功效成分的液相色譜圖見圖1（峰編號同表2成分編號）。

圖 1 11 種功效成分標(biāo)準(zhǔn)的液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of 11 functional components standards

2.5 檢測器和波長的選擇

本實(shí)驗(yàn)考慮到幾種物質(zhì)的最大吸收波長各不相同，同時考慮VB2、VB6（吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛）及褪黑素具有熒光，且激發(fā)和發(fā)射波長也不盡相同，故采用PDA串聯(lián)FLD多通道多波長的檢測方法，檢測器及波長選擇見表2。其中VB2及褪黑素還可同時采用PDA檢測器選擇260 nm波長定性和定量，以達(dá)到最靈敏最準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

2.6 線性范圍

分析提取液配成的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積（Y）-質(zhì)量濃度（X）作校正曲線，得到線性回歸方程，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，結(jié)果見表2。

表 2 方法的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations with correlation coefficients and linear ranges for 11 functional components

2.7 回收率、精密度及定量限

表 3 多種維生素片中11 種功效成分的添加回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and precision for 11 functional components in multivitamin tablets (ts (n = 6)

采用本方法在多種維生素片、保健飲料中各添加3 個水平的11 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個添加實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定6 次，計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。2種基質(zhì)中11 種功效成分的回收率在86.4%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%～11.7%，結(jié)果見表3、4。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合保健食品含量分析的要求[20]。結(jié)果表明，不同基質(zhì)樣品中煙酸、煙酰胺不小于20 mg/kg，其余9 種功效成分含量不小于10 mg/kg水平時，信噪比（RSN）均大于10，且回收率和精密度滿意，因此以煙酸、煙酰胺20 mg/kg，其余9 種功效成分10 mg/kg作為方法的定量限；以信噪比為3計算11 種功效成分的檢出限，其中煙酸、煙酰胺為6.0 mg/kg，其余9 種功效成分為3.0 mg/kg。

表 4 保健飲料中11 種功效成分的添加回收率和精密度（n=6）Table 4 Recoveries and precision for 11 functional components in health drink samples (s (n = 6)

2.8 實(shí)際樣品測定結(jié)果

采用本方法對10 種樣品共30 份（谷物提取物復(fù)合片、松果體素片、多種營養(yǎng)素咀嚼片、天然B族維生素片、兒童水果口味軟糖、5 種多功能性飲料各3 份）進(jìn)行測定。其中，谷物提取物復(fù)合片中檢出了VB2（1.04×103mg/kg）、煙酰胺（1.25×103mg/kg）、吡哆醇（1.23×103mg/kg）、VB1（667 mg/kg）；松果體素片中檢出了煙酰胺（400 mg/kg）、吡哆醇（1.18×103mg/kg）、褪黑素（3.39×103mg/kg）；多種營養(yǎng)素咀嚼片中檢出了吡啶甲酸鉻（120 mg/kg）、VB2（330 mg/kg）、煙酰胺（3.77×103mg/kg）、吡哆醇（355 mg/kg）、VB1（300 mg/kg）；天然B族維生素片中檢出了VB2（2.98×103mg/kg）、煙酰胺（1.52×104mg/kg）、吡哆醇（2.56× 103mg/kg）、褪黑素（155 mg/kg）、吡哆胺（80.5 mg/kg）、VB1（2.62×103mg/kg）；兒童水果口味軟糖中檢出吡哆胺（688 mg/kg）；4種多功能飲料都被檢出咖啡因（126～142 mg/kg）；煙酰胺（16.1～16.5 mg/kg）；吡哆醇（1.21～1.33 mg/kg）；褪黑素（1.33×103～1.40×103mg/kg）；1種多功能飲料被檢出紅景天苷（575 mg/kg）。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究高效液相色譜法同時檢測保健食品中VB1、VB2、VB6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）、煙酸、煙酰胺、吡啶甲酸鉻、褪黑素、咖啡因、紅景天苷11 種功效成分。通過對前處理?xiàng)l件和高效液相色譜條件的優(yōu)化，建立合理、可靠的且能同時檢測保健食品中11 種功效成分的液相色譜測定方法。該方法對11 種功效成分分離效果好，以信噪比為3計算11種功效成分的檢出限，其中煙酸、煙酰胺為6.0 mg/kg，其余9 種功效成分為3.0 mg/kg；以信噪比為10的條件下，計算11 種功效成分的定量限，煙酸、煙酰胺為20 mg/kg，其余9 種功效成分為10 mg/kg。方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能滿足對保健食品中VB1等11 種功效成分同時檢測的監(jiān)控需求[23]。

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Simultaneous Determination of 11 Functional Components in Health Foods by High Performance Liquid Chromatography

CHEN Yufang, LIN Haidan, WU Hongzhong, JIN Meng, SONG Yang, LIANG Xiaoru, XIE Yushan, GUAN Yongyi
(Inspection and Quarantine Technology Center, Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510623, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed for simultaneous determination of 11 functional components in health foods. Samples were extracted with methanol-water-phosphoric acid solution/ n-hexane-methanol-water-phosphoric acid solution (for lipid-containing samples). Analysis was performed using an HPLC system equipped with an Agilent TC- C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) and a PDA/FLR detector with a mobile phase composed of acetonitrile and 2 g/L sodium octanesulfonate solution (containing 1 mL of phosphoric acid) at a flow rate of 1.0 mL/min with gradient elution. Good linearity was observed in the range of 0.25–25 mg/L for vitamin B2, 0.5–20 mg/L for vitamin B6, 1–100 mg/L for nicotinic acid and nicotinamide, 0.5–50 mg/L of the other five functional components with correlation coefficients of 0.999 1–1.000 0. The average recoveries in health foods were in the range of 86.4%–110% at three spiked levels with relative standard deviations varying between 0.21% and 11.7% (n = 6). The limit of quantification was 20 mg/kg for nicotinic acid and nicotinamide, and 10 mg/kg for the remaining nine functional components.

high performance liquid chromatography (HPLC)； water-soluble vitamin； chromium picolinate；melatonine； salidroside

O657.72

A

1002-6630（2015）08-0244-06

10.7506/spkx1002-6630-201508046

2014-07-16

陳毓芳（1968—），女，高級工程師，學(xué)士，主要從事食品和化妝品檢測研究。E-mail：fangyuc@163.com