化能自養(yǎng)菌氨單加氧酶基因的克隆

龔國利， 張　甜， 史政豪， 魏選明， 王　磊

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

?

化能自養(yǎng)菌氨單加氧酶基因的克隆

龔國利， 張?zhí)穑?史政豪， 魏選明， 王磊

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安710021)

摘要：氨氧化細(xì)菌是一類革蘭氏陰性的化能自養(yǎng)菌.也是生物脫氮工藝中不可缺少的一類細(xì)菌.本研究通過以土壤為材料富集氨氧化細(xì)菌，并從富集土樣的全基因組中成功擴增到amoA全長基因，與NCBI標(biāo)準(zhǔn)菌株Nitrosomonas sp. GH22序列同源性達到99%，并用amoA全長基因構(gòu)建得克隆載體，經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定正確，為后期構(gòu)建新型的生物脫氮基因工程菌奠定基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：氨氧化細(xì)菌; 生物脫氮; 鑒定

0引言

自養(yǎng)細(xì)菌分為光能自養(yǎng)菌和化能自養(yǎng)菌，光能自養(yǎng)菌(微生物)一般都含有葉綠體，而化能自養(yǎng)菌又稱為無機營養(yǎng)菌，是一類不依賴任何有機營養(yǎng)物即可生長、繁殖的微生物.這類微生物能氧化某種無機物并利用所產(chǎn)生的化學(xué)能還原二氧化碳和生成有機碳化合物.自然界中化能自養(yǎng)菌種類不多，并且氧化無機物的專性很強，例如硝化細(xì)菌只能氧化亞硝酸鹽.化能自養(yǎng)菌在土壤中有相當(dāng)數(shù)量，對物質(zhì)轉(zhuǎn)化有一定作用.

隨著當(dāng)代工業(yè)和社會的快速發(fā)展，向環(huán)境中排放大量生活污水及工業(yè)污水，而這些污水的主要污染成分又以氨態(tài)氮、分子氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮等為主，如若這些污水不經(jīng)處理直接排入江河中會造成水體富營養(yǎng)化，也會對人和生物體造成毒害作用[1].近年來世界各國人民的環(huán)保意識越來越強 ，對于水體污染處理也形成了許多新型工藝，如SHARON工藝、CANON工藝、OLAND工藝、單級自養(yǎng)脫氮工藝等[2,3].這些工藝的共同點就是在脫氮過程是基于氨氧化細(xì)菌存在的基礎(chǔ)上進行的[4]，可將氨氮轉(zhuǎn)化成亞硝態(tài)氮，有氧條件下，反應(yīng)方程為：2NH3+3O2→2HNO2+2H2O+能量.

氨氧化細(xì)菌的氨單加氧酶基因(amoA)[5]，它可將銨氧化成羥胺，再通過氨氧化細(xì)菌的羥胺氧化酶基因(hao)使羥胺轉(zhuǎn)化成亞硝酸來實現(xiàn)亞硝化作用[6]，屬革蘭氏陰性專性化能自養(yǎng)細(xì)菌，以銨鹽的氧化滿足其能量需求，普遍分布在自然界的土壤、海洋及淡水中，但只占其中細(xì)菌總量的極小比例，且不同種屬的氨氧化細(xì)菌所分布的環(huán)境不同.自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌由于其生長緩慢和較難培養(yǎng)的緣故，因此直接從土壤中分離到純種的氨氧化細(xì)菌有一定的難度.

本研究通過對采集的土壤樣品[7]進行多次富集后提取土壤樣品的全基因組擴增amoA基因，并構(gòu)建克隆載體測序，為將來構(gòu)建生物脫氮的基因工程菌提供了基礎(chǔ)依據(jù).

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑及菌株

PMD18-T vector、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ均購自大連寶生物公司、細(xì)菌基因組提取試劑盒和膠回收試劑盒由北京天根生化有限公司提供、2×Power Taq PCR MasterMix購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR引物均由上海捷瑞生物公司提供、IPTG、X-Gal、氨芐青霉素(Sigma Cheminal Co.)、瓊脂糖、大腸桿菌DH5α為本實驗室保存.酵母浸粉、大豆蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、NaCl(天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠)、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O 、CaCl2均為分析純.

1.1.2儀器

儀器：PCR儀、電泳儀、電泳槽(BIO-RAD)、BIS910凝膠成像系統(tǒng)(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)、TGL-16M高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機有限責(zé)任)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實驗有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、SHZ-82氣浴恒溫振蕩器(金壇市榮華儀器制造有限公司)、移液槍(Eppendorf公司).

1.2方法

1.2.1氨氧化細(xì)菌的富集培養(yǎng)[8,9]

氨氧化細(xì)菌富集培養(yǎng)基 (NH4)2SO45 g，KH2PO40.7 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.36 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.2，121 ℃高溫滅菌30 min.

選取陜西科技大學(xué)花園土壤，稱取1 g土壤樣品于100 mL氨氧化細(xì)菌富集培養(yǎng)基中，磁力攪拌器攪拌使土樣完全分散，搖床30 ℃、150 r/min富集15～30 d，每隔兩天用格里斯試劑進行檢驗，待到富集液與格里斯試劑顯粉色時即代表氨氧化細(xì)菌氧化銨鹽生成一定數(shù)量的NO2-，培養(yǎng)液是否變紅及其顏色深淺可指示NO2-的生成及其濃度，NO2-可與格里斯試劑共同作用生成橙紅色的絡(luò)合物[10].將生成紅色較深的土樣富集液繼續(xù)轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮的氨氧化細(xì)菌富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)富集3～4次后即可提取富集土樣的基因組進行后續(xù)實驗.

1.2.2PCR擴增amoA全長基因

引物設(shè)計在NCBI Genbank上查找序列登錄號L08050[11]amoA全長基因設(shè)計引物amof/amor、amo-1F/amo-2R,引物序列見表1所示.

表1　amoA基因擴增的引物序列

(1)富集土壤總DNA的提取

取富集3次的土壤渾濁液2 mL，根據(jù)試劑盒提取土壤的總DNA.

(2)amoA全長基因的擴增

PCR反應(yīng)體系50μL，DNA模板2μL、上游引物amof(10μmol/L)2μL、下游引物amor(10μmol/L)2μL、2×Power Taq PCR MasterMix 25μL、補水至50μL.

PCR反應(yīng)條件:首先94 ℃變性3 min；然后30個循環(huán)：94 ℃ 30 s、48 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min；最后是72 ℃延伸5 min，4 ℃保存.PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析后進行切膠回收.

(3)以切膠回收的amoA全長基因組為模板進行套式PCR驗證[12]

PCR反應(yīng)體系20μL，DNA模板1μL、上游引物amo-1F(10μmol/L)1μL、下游引物amo-2R(10μmol/L)1μL、2×Power Taq PCR MasterMix 10μL、補水至20μL.

PCR反應(yīng)條件:首先94 ℃變性3 min；然后30個循環(huán)：94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min 30 s、72 ℃ 1 min；最后是72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析.

1.2.3amoA基因的克隆[13]

(1)LB液體培養(yǎng)基

酵母浸粉0.5 g，大豆蛋白胨1.0 g，NaCl 1 g，蒸餾水100 mL，121 ℃高溫滅菌30 min.

(2)克隆載體PMD18-T-amoA的構(gòu)建

amoA基因克隆載體PMD18-T vector連接，10μL反應(yīng)體系：PMD18-T vector 1μL、amoA基因模板4μL、連接緩沖液SolotionⅠ 5μL ；16 ℃連接30 min.

PMD18-T-amoA轉(zhuǎn)化感受態(tài)及PCR驗證.將制備好的感受態(tài)細(xì)胞[14]從-80 ℃冰箱中拿出后置于碎冰上融解，然后加入10μL連接產(chǎn)物，混勻，冰上放置25 min；移入42 ℃水浴中放置90 s(秒表記)后，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻5 min，加入0.2 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h后涂布含有Amp、IPTG和X-Gal的平板，過夜培養(yǎng)后挑取白色菌落進行菌落PCR驗證，驗證用M13通用引物.

1.2.4PMD18-T-amoA陽性菌落的篩選和鑒定

對于驗證后的菌落挑選后進行擴大培養(yǎng)，抽質(zhì)粒后進行雙酶切驗證，驗證正確后送測序公司測序.

(1)PMD18-T-amoA陽性菌落PCR驗證

PCR反應(yīng)體系20μL，DNA模板1μL、上游引物M13f(10μmol/L)1μL、下游引物M13r(10μmol/L)1μL、2×Power Taq PCR MasterMix 10μL、補水至20μL.

PCR反應(yīng)條件:首先95 ℃變性5 min；然后30個循環(huán)：95 ℃ 30 s、42 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min；最后是72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析.

(2)陽性菌落的雙酶切鑒定

雙酶切驗證體系50μL.EcoRⅠ 1μL、SalⅠ 1μL、質(zhì)粒30μL、10×H buffer 5μL、補水至50μL.

1.2.5測序及序列同源性分析

測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成.測序結(jié)果提交GenBank進行blast分析.

2結(jié)果與討論

2.1amoA基因的擴增和套式PCR驗證

2.1.1amoA基因的擴增

利用引物amof/amor對富集的土壤全基因組進行擴增，擴增到一段約830 bp的片段(見圖1所示)，與文獻記載相符[13].

1、2為PCR擴增amoA全長基因圖1　PCR擴增amoA全長基因

2.1.2 以擴增到的amoA基因為模板

利用引物amo-1F/amo-2R進行套式PCR，擴增到一段約500 bp左右的條帶(見圖2所示)，與文獻記載相符[12].

1、2為PCR擴增amoA基因片段圖2　amoA基因套式PCR

2.2克隆載體PMD18-T-amoA挑選重組子進行菌落PCR驗證

克隆載體PMD18-T-amoA挑選24個重組子進行菌落PCR驗證，24個重組子依次命名為a1-a24(見圖3所示).

1～24:a1～a24號重組子菌落PCR驗證圖3　克隆載體PMD18-T-amoA重組子驗證

從圖3可看出，除a2、a3號重組子之外，在830 bp附近都有有明亮的條帶，初步說明已將目的片段連入克隆載體，挑選除a2、a3號外的任意兩個重組子進行過夜培養(yǎng)后進行雙酶切驗證.

2.3克隆載體PMD18-T-amoA挑選重組子進行雙酶切驗證

克隆載體PMD18-T-amoA挑選a8、a11過夜培養(yǎng)抽質(zhì)粒進行雙酶切驗證(見圖4所示).

1：a8 EcoRⅠ/ SalⅠ雙酶切；2：a8質(zhì)粒；3：a11 EcoRⅠ/ SalⅠ雙酶切；4：a11質(zhì)粒圖4　克隆載體PMD18-T-amoA重組子雙酶切驗證

雙酶切下來一條約3 000 bp和830 bp的條帶，進一步說明目的基因連接到克隆載體.

2.4amoA基因的測序結(jié)果

送a8和a11測序，其中a8的基因測序結(jié)果如下，a11測序結(jié)果未顯示.

GTATATTTAGAACGGAAGAGATCCTGAAAGC

GGCCAAGATGCCGCCGGAAGCGGTCCATATG

TCACGCCTGGTTGATGCGGTTTATTTTCCGAT

TCTGGTTGTTCTGTTGGTAGGTACCTACCATA

TGCATTTCATGTTGTTGGCAGGTGACTGGGAT

TTCTGGATGGACTGGAAAGATCGTCAATGGT

GGCCTGTAGTAACACCTATTGTGGGCATTACC

TATTGCTCGGCAATTATGTATTACCTGTGGGT

CAACTACCGTCAACCATTTGGTGCGACTCTG

TGCGTAGTGTGTTTGCTGATAGGTGAGTGGC

TGACACGTTACTGGGGTTTCTACTGGTGGTC

ACACTATCCACTCAATTTTGTAACCCCAGGTA

TCATGCTCCCGGGTGCATTGATGTTGGATTTC

ACAATGTATCTGACACGTAACTGGTTGGTGA

CTGCATTGGTTGGGGGTGGATTCTTTGGCCT

GATGTTTTACCCGGGTAACTGGCCAATCTTTG

GCCCGACCCATCTGCCAATCGTTGTAGAAGG

AACACTGTTGTCGATGGCTGACTACATGGGT

CACCTGTATGTTCGTACGGGTACACCTGAGTA

TGTTCGTCATATTGAACAAGGTTCATTACGTA

CCTTTGGTGGTCACACCACAGTTATTGCGGC

ATTCTTCGCTGCGTTTGTATCCATGCTGATGTT

TGCAGTCTGGTGGTATCTTGGAAAAGTTTAC

TGCACAGCCTTCTTCTACGTTAAAGGTAAAA

GAGGACGTATCGTACAGCGCAATGATGTTAC

GGCATTTGGTGAAGAAGGGTTTCCAGAGGG

GATCAAATAA

2.5amoA基因在NCBI的同源性比對結(jié)果

a8序列通過NCBI在線blast分析，與a8序列同源比對后相似較高的基因序列見圖5所示.

圖5　a8序列在NCBI的同源性比對結(jié)果

2.6amoA基因進化樹的構(gòu)建

挑選序列同源相似性較高的序列使用MEGA6.0做進化樹分析[15，16]，見圖6，分析結(jié)果說明擴增到的amoA基因確實是氨氧化細(xì)菌的amoA基因.

圖6　a8序列進化樹分析

2.7討論

從富集土壤樣品擴增得到的amoA基因有827 bp，從圖5可看出在NCBI通過同源比對后，得到a8序列與Nitrosomonassp.GH22序列同源相似性達到99%；由圖3可見，用M13通用引物進行菌落PCR驗證，在830 bp附近有清晰地目標(biāo)條帶；雙酶切下來兩個條帶，由圖4可看出，一段約3 000 bp，為克隆載體的序列長度，一段約830 bp，為目的基因amoA序列長度，進一步證明了目的基因的正確性.

選擇PMD18-T，帶有Amp抗性，是一種高效連接的克隆載體，可以在30 min內(nèi)與目標(biāo)片段相連，轉(zhuǎn)化的宿主菌選擇E.coli DH5α，帶有乳糖操縱子的調(diào)控區(qū)和連接目標(biāo)片段的質(zhì)粒在含有IPTG作為誘導(dǎo)物，以X-Gal為顯色劑的固體培養(yǎng)基上，由于乳糖操縱子中的LacZ的釋放的產(chǎn)物半乳糖苷酶，切割顯色劑使吲哚基產(chǎn)生藍(lán)色，被破壞的Lac菌株則產(chǎn)生白色菌落[16].因此把外源基因插入Lac的質(zhì)粒上，就可通過菌落的顏色進行篩選.

3結(jié)束語

本研究無須長時間的分離培養(yǎng)純種的氨氧化細(xì)菌，節(jié)省工作時間，通過富集土樣后直接提取全基因組進行PCR擴增amoA基因，并且連接克隆載體進行測序，雙酶切的基因可以進一步用于后續(xù)表達載體的構(gòu)建，為構(gòu)建新型的生物脫氮基因工程菌提供了依據(jù).

參考文獻

[1] 吳婉娥，葛紅光，張克峰.廢水生物處理技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003:167-168.

[2] 呂錫武,李峰,稻森悠平,等.氨氮廢水處理過程中的好氧反硝化研究[J].中國給水排水,2000,26(4):17-20.

[3] 鄭興燦,李亞新.污水除磷脫氮技術(shù)[M].北京:中國建筑工業(yè)出版社,1998:11-19.

[4] 鄭平，徐向陽，胡寶蘭.新型生物脫氮理論與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2004.

[5] Klotz M G,Alzerreca J,Norton J M.A gene encoding a membrance protein exists upstream of the amoA/amoB genes in ammonia oxidizing bacteria：A third member of the amo operon[J].FEMS Microbiology Letters，1997,150:65-73.

[6] Rotthauwe J H,Deboer W,Liesack W.Comparative analysis of gene sequences encoding ammonia monooxygenase of Nitrosospira sp.AHB1 and Nitrosolobus multiformis C-71[J].FEMS Microbiology Letters，1995，133(1-2):131-135.

[7] 孫棟，唐莉麗，王倩倩，等.高鹽極端環(huán)境土壤基因組DNA的分離純化方法研究及基因文庫的構(gòu)建[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2006,25(1):24-29.

[8] 廖雪義，藍(lán)榮.亞硝化細(xì)菌的分離及初步鑒定[J].生物技術(shù)，2008,18(6)：50-52.

[9] 郭愛蓮，李振海，黃淑菊.硝化細(xì)菌的分離研究[J].西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),1996,26(1):83-86.

[10] 張輝，李培軍，胡筱敏，等.亞硝化細(xì)菌的篩選及培養(yǎng)條件的研究[J].化工環(huán)保,2006,26(5):366-369.

[11] McTavish H，Hopper A B，F(xiàn)uchs J A.Sequence of the gene coding for ammonia monooxygenase in Nitrosomonas europaea[J].Journal of Bacteriology，1993,175:2 436-2 444.

[12] 陳春蘭，陳哲，朱亦君，等.水稻土細(xì)菌硝化作用基因(amoA)和(hao)多樣性組成與長期稻草還田的關(guān)系研究[J].環(huán)境科學(xué),2010,31(6)：1 624-1 632.

[13] 李君文，周娟，王新為，等.亞硝酸細(xì)菌amoA基因的克隆、測序與表達[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2004,10(3)：345-348.

[14] 楊坤，鞏振輝，李大偉.大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞的制備及快捷轉(zhuǎn)化體系的建立[J].北方園藝，2010,34(14)：127-130.

[15] 黃建軍，簡紀(jì)常，吳灶和,等.一株海水氨氧化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報,2008,28(3):88-92.

[16] 陳嶺.氨單加氧酶基因(amoA)在氨氧化細(xì)菌種群分析和定量檢測中的應(yīng)用研究[D].杭州：浙江大學(xué),2003.

To clone the ammonia monooxygenase gene of autotrophic

bacteria ammonium oxidation capacity

GONG Guo-li， ZHANG Tian, SHI Zheng-hao, WEI Xuan-ming, WANG Lei

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:Ammonia oxidizing bacteria is a class of gram negative chemoautotrophic bacteria,and it is also a kind of indispensable in the process of biological removal of nitrogen.In this study,the amoA gene was successfully amplified from the whole genome of the enriched soil sample,then put this amoA gene sequence blasted in Genbank through Internet online;at last,we get a result that it has high homology with the amoA gene of Nitrosomonas sp. GH22(99%).According to the amoA full-length gene constructed a cloned vector,through the identification of colony PCR and restriction analysis were correct,to lay the foundation for the later construction of a new biological nitrogen removal genetically engineered bacteria.

Key words:ammonia oxidizing bacteria； biological nitrogen removal； identify

中圖分類號：R285.5

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-5811(2015)05-0125-05

作者簡介:龔國利(1976-)，男，內(nèi)蒙古豐鎮(zhèn)人，教授，博士，研究方向：微生物發(fā)酵

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(20906085)； 陜西科技大學(xué)學(xué)術(shù)骨干培育計劃項目(XSG2010009)

收稿日期:*2015-05-19