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    保留型與反轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性位點(diǎn)的分子動力學(xué)模擬

    2015-12-29 02:33:27張俊威周峻崗
    物理化學(xué)學(xué)報 2015年6期
    關(guān)鍵詞:殘基供體質(zhì)子

    張俊威 周峻崗 呂 紅 黃 強(qiáng)

    (1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心,上海200433;2上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海200237)

    保留型與反轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性位點(diǎn)的分子動力學(xué)模擬

    張俊威1周峻崗1,*呂 紅1,2黃 強(qiáng)1,2,*

    (1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心,上海200433;2上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海200237)

    木聚糖是潛在的重要可再生能源,如何提高其降解效率已成為近年來的研究熱點(diǎn).β-木糖苷酶是木聚糖降解過程中的關(guān)鍵酶之一,按其水解機(jī)制可分為保留型與反轉(zhuǎn)型酶.目前雖然對于這兩種催化機(jī)制的研究不斷深入,但很少有工作從溶液環(huán)境的角度出發(fā)探究它們的差異.本文采用分子動力學(xué)模擬方法,對4個典型的β-木糖苷酶進(jìn)行了顯式溶劑模擬研究,詳細(xì)分析了酶的催化氨基酸間的距離和質(zhì)子供體氨基酸p Ka值的動態(tài)變化.結(jié)果顯示,反轉(zhuǎn)型酶催化氨基酸間的距離約為0.8-1.0 nm,大于保留型的0.5-0.6 nm,與先前對糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析結(jié)果一致.令人意外的是,保留型酶的質(zhì)子供體通過與其附近組氨酸的相互作用,其p Ka在兩個不同的高、低值之間交替變換,使保留型酶的雙取代反應(yīng)得以發(fā)生;而反轉(zhuǎn)型酶的質(zhì)子供體則由附近的天冬氨酸調(diào)節(jié),其p Ka穩(wěn)定在某個較高值,這可能有利于其在反應(yīng)pH值下獲得水溶液中的氫離子,進(jìn)行反轉(zhuǎn)型酶特有的單取代反應(yīng).因此,本工作加深了人們對β-木糖苷酶保留型與反轉(zhuǎn)型水解機(jī)制的認(rèn)識,并為后續(xù)酶的理性改造與高效利用提供具有指導(dǎo)價值的結(jié)構(gòu)與機(jī)理信息.

    β-木糖苷酶;催化機(jī)制;分子建模;質(zhì)子供體;p Ka值

    1 引言

    隨著石油等化石類能源的不斷減少,生物質(zhì)能源逐漸受到了人們的關(guān)注.雖然木質(zhì)纖維素等生物能源具有再生性、清潔低碳及原料豐富等優(yōu)勢,但是目前生物質(zhì)的利用率還很低.因此,如何高效地利用生物質(zhì)能源已成為一個急需解決的生物技術(shù)問題和當(dāng)前的研究熱點(diǎn).1,2

    木聚糖作為半纖維素的主要組成部分,3是重要的待開發(fā)的生物質(zhì)能源.β-木糖苷酶是木聚糖降解過程中關(guān)鍵酶之一,分布廣泛,主要存在于植物、真菌和細(xì)菌中.4,5該酶以外切方式作用于木寡糖和木二糖的β-1,4-糖苷鍵,可減緩低聚木糖等中間產(chǎn)物對內(nèi)切木聚糖酶的抑制作用,6進(jìn)而加快木聚糖的整體降解效率.根據(jù)水解產(chǎn)物的異頭碳構(gòu)型在反應(yīng)前后是否保留或反轉(zhuǎn),可將β-木糖苷酶的催化機(jī)制分為保留型和反轉(zhuǎn)型.7已發(fā)現(xiàn)的β-木糖苷酶大多采用保留型機(jī)制,分布于糖苷水解酶GH3、GH39、GH52和GH54家族;而少數(shù)β-木糖苷酶為反轉(zhuǎn)型酶,僅存在于GH8和GH43家族(http://www.cazy.org).

    目前人們已經(jīng)比較清楚:β-木糖苷酶的水解過程為一般意義上的酸堿催化反應(yīng),活性位點(diǎn)處需要兩個關(guān)鍵的催化氨基酸,一個作為質(zhì)子供體,另一個作為親核試劑.8,9其中,保留型酶采用雙取代反應(yīng)機(jī)制:10首先由質(zhì)子供體為糖苷鍵氧原子提供一個質(zhì)子,促使糖苷鍵斷裂,接著親核試劑進(jìn)攻糖基的異頭碳,形成穩(wěn)定中間體,最后質(zhì)子供體協(xié)助進(jìn)入活性中心的水分子進(jìn)攻糖基的碳正離子,完成糖基取代反應(yīng)(圖1a);反轉(zhuǎn)型酶則采用單取代機(jī)制:11先由質(zhì)子供體為底物糖苷鍵的氧原子提供一個質(zhì)子,同時親核試劑與活性中心的水分子反應(yīng),使水分子解離產(chǎn)生羥基,并與糖苷鍵的碳正離子結(jié)合,從而打開糖苷鍵(圖1b).

    在上述水解過程中,保留型酶較易發(fā)生轉(zhuǎn)糖基作用,因此其水解效率不如反轉(zhuǎn)型酶的效率高.12人們推測一個主要原因可能是保留型酶的水解過程需越過兩個反應(yīng)過渡態(tài)(圖1a),而反轉(zhuǎn)型酶只有一個過渡態(tài)(圖1b).總的說來,對于決定β-木糖苷酶水解效率的關(guān)鍵因素,人們還是知之甚少.因此,深入分析上述兩種水解機(jī)制的差異,揭示影響水解效率的主要因素,對β-木糖苷酶的開發(fā)與應(yīng)用具有重要意義.已有一些研究工作對兩種催化機(jī)制間的差別進(jìn)行了一定的探討,13例如,比較分析了多種糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)中催化氨基酸之間的距離,14以及它們的p Ka值15,16等.不過,這些工作基本上是以酶的靜態(tài)結(jié)構(gòu)為分析基礎(chǔ)的,關(guān)于在溶液環(huán)境中酶活性位點(diǎn)動態(tài)變化的分析還很少見報道.所以,本文應(yīng)用分子動力學(xué)(MD)模擬方法對溶液環(huán)境中β-木糖苷酶活性位點(diǎn)的動態(tài)行為進(jìn)行研究.分子動力學(xué)模擬作為實(shí)驗(yàn)方法的補(bǔ)充,能夠詳細(xì)了解溶液中生物大分子的微觀結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)和動力學(xué)性質(zhì)等相關(guān)信息,17從而在微觀層面解釋蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能.18本文以保留型與反轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶為對象,通過顯式溶劑的分子動力學(xué)模擬,分析酶活性位點(diǎn)中催化氨基酸間的距離、質(zhì)子供體氨基酸p Ka的動態(tài)變化,從而深入理解β-木糖苷酶保留型與反轉(zhuǎn)型水解機(jī)制間的差異,為后續(xù)的酶的理性改造和高效利用提供了具有指導(dǎo)意義的信息.

    2 計算方法

    2.1 MD模擬體系的選擇與構(gòu)建

    在本工作開始時,我們仔細(xì)檢索了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank,http://www.rcsb.org),發(fā)現(xiàn)具有完整晶體結(jié)構(gòu)的β-木糖苷酶共有8個.其中, GH39家族的兩個酶(PDB codes:1PX8,194EKJ20)和GH43家族的兩個酶(PDB codes:2EXH,213C2U22)的催化機(jī)制已較為明確,且分別代表了保留型與反轉(zhuǎn)型酶,其詳細(xì)信息見表1.因此,本工作選取這4個晶體結(jié)構(gòu)建立MD模擬體系.

    利用上述晶體結(jié)構(gòu),使用GROMACS(版本: 4.6.5)軟件包23的pdb2gmx模塊構(gòu)建了4個β-木糖苷酶的全原子模型.為了進(jìn)一步了解酶催化氨基酸p Ka值的變化情況,對表1中的質(zhì)子供體氨基酸進(jìn)行質(zhì)子化與非質(zhì)子化處理,以模擬該殘基兩種不同的質(zhì)子化狀態(tài).這樣,為表1中的每一個β-木糖苷酶各構(gòu)建了2個MD模擬體系.對每個體系,都采用Amber99sb力場24描述其原子的各種參數(shù),并按全原子顯式溶劑方法構(gòu)建:首先把酶置于立方盒子中央,使其離盒子邊界至少1.2 nm,然后往盒子中加入水分子,水分子模型為TIP3P,25最后加入一定數(shù)目的鈉離子(Na+)與氯離子(Cl-),使體系的離子濃度值為150mmol·L-1,且體系保持中性,總電荷數(shù)為零.

    圖1 保留型(a)和反轉(zhuǎn)型(b)β-木糖苷酶的催化機(jī)制Fig.1 Catalyticmechanismsof retaining(a)and inverting(b)β-xylosidases

    表1 4個β-木糖苷酶的催化機(jī)理及催化氨基酸Table1 Catalyticmechanismsand catalytic am ino-acids of fourβ-xylosidases

    2.2 分子動力學(xué)模擬

    采用GROMACS的mdrun模塊進(jìn)行MD模擬.模擬開始前,用最速下降法對體系進(jìn)行5000步能量最小化,消除體系內(nèi)可能存在的不合理的原子位置或接觸.然后,對體系進(jìn)行預(yù)平衡模擬:在約束蛋白質(zhì)重原子位置的情況下,進(jìn)行100 ps的恒溫恒容(NVT)模擬,使體系溫度達(dá)到并保持在300 K;然后,在恒溫恒壓(NPT)條件下,繼續(xù)對體系平衡1000 ps,使體系的壓強(qiáng)保持在105Pa.預(yù)平衡模擬結(jié)束后,不再約束重原子的位置,接著進(jìn)行時間尺度為20 ns的NPT模擬,產(chǎn)生用于后續(xù)分析的MD模擬軌跡.在模擬中,積分步長為2 fs,長程靜電相互作用采用particle-mesh Ewald(PME)方法26計算,用Berendsen弱耦合作用27穩(wěn)定體系的溫度和壓強(qiáng),耦合時間常數(shù)為0.1 ps.模擬過程中,每2 ps保存一次體系原子的坐標(biāo)與速度,以用于后續(xù)分析.模擬軌跡的顯示與構(gòu)象分析主要用VMD(版本:1.9.1)28與PYMOL(版本:1.4.1)29完成.

    2.3 MD模擬軌跡分析

    2.3.1 催化氨基酸間距離的計算

    在水解反應(yīng)發(fā)生時,β-木糖苷酶的質(zhì)子供體氨基酸帶有一個質(zhì)子(圖1).為了解在水解反應(yīng)的條件下酶的兩個催化氨基酸之間的距離,我們按2 ps的間隔從相應(yīng)酶體系的MD模擬軌跡中提取酶原子的位置坐標(biāo),生成相應(yīng)的PDB文件,然后使用與文獻(xiàn)30類似的方法計算β-木糖苷酶的兩個催化殘基之間的距離.首先,按圖2的方式定義兩個催化氨基酸羧基氧原子的位置,然后用距離公式d=[(x1-x2)+(y1-y2)+ (z1-z2)]1/2分別計算酶Oδ1或Oδ2到Oε1、Oε2之間的距離(即d11、d12、d21和d22),再取這四個值的平均值得到表征催化氨基酸之間距離的統(tǒng)計值Doo=(d11+d12+d21+ d22)/4.

    2.3.2 質(zhì)子供體氨基酸p Ka值的計算

    在一定的pH條件下,蛋白質(zhì)中酸性與堿性氨基酸可根據(jù)其自身的p Ka值來調(diào)節(jié)其質(zhì)子化狀態(tài),31從而影響蛋白質(zhì)的功能.32由于β-木糖苷酶的質(zhì)子供體氨基酸在反應(yīng)pH值下需帶上一個質(zhì)子,水解反應(yīng)才能發(fā)生(圖1).因此,分析該氨基酸殘基p Ka值的動態(tài)變化,可以了解其在反應(yīng)pH值下是否帶有水解反應(yīng)所必需的質(zhì)子.如上所述,為準(zhǔn)確計算該氨基酸殘基p Ka值,我們構(gòu)建了4個相應(yīng)的、質(zhì)子供體氨基酸不帶質(zhì)子的酶模擬體系.同樣,按2 ps的間隔從這些酶體系的模擬軌跡中提取酶原子的位置坐標(biāo),生成PDB文件后,用PROPKA(版本:3.1)33分別計算出各PDB文件中質(zhì)子供體氨基酸的p Ka值.

    3 結(jié)果與討論

    3.1 酶氨基酸殘基的波動分析

    為判斷各模擬體系到達(dá)平衡的模擬時間,用GROMACS的g_rms模塊分別計算上述8個體系中酶的Cα原子相對于初始結(jié)構(gòu)的均方根偏差(RMSD),結(jié)果如圖3所示.可以看出,各個體系經(jīng)5 ns模擬后Cα原子的RMSD值已基本趨于穩(wěn)定,說明各體系的MD模擬已達(dá)到了平衡.所以,后續(xù)各體系的分析使用的是其5-20 ns的模擬軌跡.

    為了了解模擬過程中酶的局部運(yùn)動情況,用GROMACS的g_rmsf模塊對酶催化結(jié)構(gòu)域中的每一個氨基酸殘基進(jìn)行均方根波動(RMSF)分析,結(jié)果見圖4.從圖4a、4b中的RMSF曲線來看,無論是保留型還是反轉(zhuǎn)型酶,即使是活性中心無底物存在情況下,酶的兩個催化氨基酸基本上是穩(wěn)定的,熱運(yùn)動的幅度相對較小.在模擬過程中,運(yùn)動幅度相對較大的是酶結(jié)構(gòu)外圍的氨基酸殘基,特別是非規(guī)則的環(huán)狀鏈段,如圖4(c-f)中的MD構(gòu)象所示.

    圖2 催化氨基酸殘基間距離的定義Fig.2 Definition of the distancesbetween am ino-acid residues

    圖3 8個模擬體系Cα碳原子的RMSD曲線Fig.3 Rootmean square deviation(RMSD)curvesof Cαatom s for 8 simulated system s

    3.2 催化氨基酸殘基間距離的分析

    采用表1中質(zhì)子供體氨基酸質(zhì)子化的4個酶體系的模擬軌跡,根據(jù)上述距離Doo的計算式分別計算了保留型和反轉(zhuǎn)型酶的催化氨基酸間距離Doo隨模擬時間變化的情況及其概率分布(圖5).由圖可見,隨著模擬時間的增加,Doo趨向于穩(wěn)定值,但由于受到溶液環(huán)境中水分子的影響,Doo有小幅度的波動.利用模擬中波動較小的5-20 ns的軌跡,計算了Doo的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差:保留型酶1PX8中兩個催化殘基間的距離分布基本保持在(0.58±0.04)nm(圖5a),4EKJ則在(0.59±0.04)nm附近上下波動(圖5b);反轉(zhuǎn)型酶2EXH的距離為(0.81±0.03)nm(圖5c), 3C2U為(1.05±0.05)nm(圖5d).

    圖4催化結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基RM SFs及MD構(gòu)象Fig.4 Rootmean square fluctuations(RM SFs)of am ino-acidsand MD conformations for the catalytic dom ains

    上述結(jié)果說明,反轉(zhuǎn)型酶的兩個催化氨基酸之間的距離比保留型酶的距離要大,主要原因是反轉(zhuǎn)型酶的催化過程中有水分子的直接參與,需要較大的空間同時容納底物與水分子.這個結(jié)果也驗(yàn)證了以前的發(fā)現(xiàn):反轉(zhuǎn)型酶催化氨基酸間的距離較遠(yuǎn)(~1.0 nm),而保留型酶的距離則相對較小(~0.55 nm).14不過,Mhlongo等30對36個糖苷酶家族共136個晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn):由于家族的不同,保留型酶催化氨基酸間的距離一般為(0.48± 0.03)nm或者(0.64±0.06)nm,不完全等于0.55 nm;而反轉(zhuǎn)型酶的距離變化范圍較寬泛((0.8±0.2)nm),也不完全等于1.0 nm.本工作的結(jié)果與此相一致,同時也直接說明了溶液環(huán)境中催化殘基之間的距離基本穩(wěn)定.不難理解,這種穩(wěn)定的運(yùn)動方式有利于底物以特定的模式結(jié)合到酶的活性中心,并形成后續(xù)反應(yīng)的過渡態(tài),從而高效地催化糖苷鍵的水解反應(yīng).

    為進(jìn)一步了解距離差異產(chǎn)生的原因,我們對這2類β-木糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較,同時采用wordom程序34統(tǒng)計了催化氨基酸附近的水分子數(shù),利用VMD追蹤觀察出現(xiàn)幾率最大的水分子在催化氨基酸附近的運(yùn)動情況.從圖6可以看出,保留型酶1PX8具有典型的(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu),即分別由8個β折疊和8個α螺旋構(gòu)成;而反轉(zhuǎn)型酶2EXH則是由5組β折疊組成催化結(jié)構(gòu)域.兩者的催化結(jié)構(gòu)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)都類似口袋,且其深度限定兩者的水解方式為外切型.8然而,催化氨基酸附近水分子的運(yùn)動方式十分不同:1PX8的兩個催化殘基處于活性口袋的表面,且距離較小,此時水分子較為集中在質(zhì)子供體(Glu160)附近(圖6a),只有當(dāng)質(zhì)子供體為反應(yīng)提供質(zhì)子后,才能對其進(jìn)行活化,完成雙取代反應(yīng);而在2EXH中,質(zhì)子供體(Glu187)處于口袋表面,親核試劑(Asp15)在口袋底部,這種排布方式增加了兩個殘基間的距離,為水分子在口袋內(nèi)提供了駐留空間,使其較為集中在Asp15附近(圖6b),有利于直接參與水解反應(yīng).

    圖5 活性口袋中質(zhì)子供體與親核試劑之間距離隨模擬時間的變化(左),概率分布(中)和距離結(jié)構(gòu)示意圖(右)Fig.5 Distance changesbetween the proton donorsand the nucleophiles in active-site pocketsw ith simulated time(left),their probability distributions(m idd le),and structuraldiagram s(right)

    3.3 質(zhì)子供體p Ka值的分析

    除統(tǒng)計分析催化氨基酸之間的距離外,本工作還著重探究了酶質(zhì)子供體(谷氨酸)p Ka在MD模擬中的動態(tài)變化情況.利用p Ka值計算程序PROPKA(見計算方法),計算了各個酶模擬軌跡中的質(zhì)子供體p Ka值隨模擬時間的變化及概率分布,結(jié)果如圖7所示.由圖可見,在apo的狀態(tài)下,受活性位點(diǎn)的微環(huán)境的影響,各酶體系中質(zhì)子供體p Ka值都偏離了氨基酸的本征值(4.3).一個非常令人意外的發(fā)現(xiàn)是,在概率分布圖上,兩個保留型酶(1PX8和4EKJ)都出現(xiàn)了兩個峰值,一個值較大,另一個較小(圖7(a,b));而兩個反轉(zhuǎn)型酶(2EXH和3C2U)則分別圍繞不同的定值上下波動(圖7(c,d)).因此,我們推斷,β-木糖苷酶的催化機(jī)制不僅與活性口袋的大小有關(guān),同時也受到質(zhì)子供體p Ka值的影響.

    為了分析保留型和反轉(zhuǎn)型酶的質(zhì)子供體p Ka值之間的具體差異,同時進(jìn)一步理解溶液pH對于催化效率的影響,我們利用5-20 ns的模擬軌跡,計算了p Ka的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果列于表2.以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),不同的β-木糖苷酶水解反應(yīng)的最適pH值各不相同,但多為酸性.35,36從圖1的催化機(jī)制可見,反應(yīng)開始前β-木糖苷酶的質(zhì)子供體帶有H+,因此,處于活性中心的質(zhì)子供體的p Ka值需要大于溶液環(huán)境pH值,以保證在反應(yīng)pH值下質(zhì)子供體帶上一個H+,具備催化水解反應(yīng)的能力.由表2可以看出,反應(yīng)開始前各體系質(zhì)子供體基本處于弱堿性狀態(tài).這與前面的設(shè)想吻合,即質(zhì)子供體的p Ka值一定程度上會決定了其反應(yīng)最適pH值.

    由于木糖苷酶的催化反應(yīng)十分迅速,實(shí)驗(yàn)上難于獲得酶-底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),模擬底物存在情況下酶活性位點(diǎn)的動態(tài)性質(zhì)還有一定的難度,因?yàn)椴灰状_定底物分子在活性位點(diǎn)處的初始構(gòu)象.不過,為進(jìn)一步了解當(dāng)?shù)孜锓肿舆M(jìn)入活性中心后質(zhì)子供體p Ka值的變化情況,我們以上述4個蛋白質(zhì)中唯一含有底物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)2EXJ(2EXH的突變體:D128G)為研究對象,利用MODELLER37構(gòu)建野生型酶-底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)作為MD模擬的初始構(gòu)象.在此,根據(jù)無底物分子(apo)狀態(tài)下質(zhì)子供體(E187)的p Ka值為7.8,大于環(huán)境的pH值,對其進(jìn)行質(zhì)子化處理,然后用2.2節(jié)中的方法進(jìn)行MD模擬,其中底物木二糖分子采用GLYCAM 06力場,38并統(tǒng)計模擬軌跡(5-20 ns)的質(zhì)子供體p Ka值,結(jié)果如圖8所示.由圖中可見,當(dāng)木二糖結(jié)合到活性口袋時,質(zhì)子供體由于受到底物分子的影響,其p Ka值由apo狀態(tài)的7.8±0.4降到1.5±0.2,小于反應(yīng)溶液的pH值,此時殘基易失去質(zhì)子,并傳遞給木二糖,從而完成催化反應(yīng).可見,上述apo的結(jié)果已清晰地反映了保留型與反轉(zhuǎn)型酶質(zhì)子供體p Ka值的動態(tài)差異.

    圖6 保留型酶(a)與反轉(zhuǎn)型酶(b)的結(jié)構(gòu)及活性口袋內(nèi)水分子擴(kuò)散比較Fig.6 Com parisonsof the structuresand water diffusions in active-site pocketsof retaining(a) and inverting(b)enzymes

    圖7 質(zhì)子供體p Ka值隨模擬時間的變化及其概率分布Fig.7 p Kavalue changesof the proton donorsw ith simulated time and their probability distributions

    表2 各研究體系中質(zhì)子供體p Ka平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差Table2 M ean p Kavaluesand the standard deviations of proton donorsof all the studied system s

    3.4 保留型酶突變體中質(zhì)子供體p Ka值的分析

    對反轉(zhuǎn)型酶2EXH的研究曾發(fā)現(xiàn),質(zhì)子供體Glu187的p Ka值可以增加到7.1,但需要其附近天冬氨酸Asp128來調(diào)節(jié)并穩(wěn)定其p Ka值.39根據(jù)此結(jié)論,我們也對保留型酶1PX8的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)質(zhì)子供體Glu160附近存在一個保守的單質(zhì)子化的組氨酸His228(圖6),對質(zhì)子供體的p Ka值有影響:當(dāng)其靠近Glu160時,p Ka值降低,反之,p Ka值升高.因此,利用MODELLER分別構(gòu)建了保留型酶1PX8 (H228A)和4EKJ(H229A)的突變體,并進(jìn)行了與野生型酶完全類似的MD模擬,計算質(zhì)子供體的p Ka值,結(jié)果如圖9所示.由圖中可見,當(dāng)1PX8的His228突變?yōu)锳la(丙氨酸)時,其質(zhì)子供體p Ka值的兩個峰都往高處移動了,而4EKJ(H229A)的兩個峰則逐漸向中間靠攏,變?yōu)橐粋€單峰.由此可見,保守氨基酸His對于保留型催化機(jī)制質(zhì)子供體p Ka值的動態(tài)變化起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用.而且,很有可能可以通過改變His位點(diǎn)的氨基酸類型來轉(zhuǎn)變酶的催化機(jī)制.

    圖8 含木二糖的2EXH中質(zhì)子供體p Ka值隨模擬時間的變化及其概率分布Fig.8 Changes in p Kavalue of the proton donors in 2EXH w ith xylobiosew ith simulated timeand their probability distributions

    圖9 保留型酶突變體中質(zhì)子供體p Ka值隨模擬時間的變化及其概率分布Fig.9 Changes in p Kavaluesof the proton donors in them utantsof retaining system sw ith simulated timeand their probability distributions

    圖10 酶催化過程中質(zhì)子供體p Ka值的變化示意圖Fig.10 Schematic diagram for the p Kavalue changesof proton donors in the enzymatic catalysis

    3.5 木糖苷酶的催化機(jī)制與質(zhì)子供體p Ka值的關(guān)系

    為解釋質(zhì)子供體p Ka值是如何影響β-木糖苷酶的催化機(jī)制,基于上述結(jié)果我們提出了如圖10所示的質(zhì)子供體p Ka影響催化機(jī)制的模式.在保留型催化機(jī)制中,質(zhì)子供體的p Ka值穩(wěn)定在兩個不同的值,以滿足雙取代反應(yīng)過程中對其質(zhì)子化狀態(tài)的要求(如中間狀態(tài)TR1、TR3):10,40當(dāng)其p Ka值較高時,TR1可以充當(dāng)質(zhì)子供體,為糖苷鍵氧原子提供一個質(zhì)子,而當(dāng)其p Ka值較低時,TR3可以對進(jìn)入活性中心的水分子進(jìn)行去質(zhì)子化.在反轉(zhuǎn)型催化機(jī)制中,需穩(wěn)定在某個較高值(質(zhì)子化中間狀態(tài)TI1),這樣有利于其獲得水溶液中的H+;而當(dāng)?shù)孜镞M(jìn)入活性中心時(TI2),質(zhì)子供體的p Ka值則降至小于環(huán)境pH的較低值,為后續(xù)的反應(yīng)提供質(zhì)子,完成單取代反應(yīng).但在此過程中,質(zhì)子供體p Ka值的動態(tài)變化主要是受到附近其它保守殘基的影響:在反轉(zhuǎn)型催化機(jī)制中,其質(zhì)子供體的高p Ka值需要附近的天冬氨酸來調(diào)節(jié),穩(wěn)定其p Ka值;39而保留型機(jī)制中,組氨酸通過調(diào)節(jié)其與質(zhì)子供體間的距離,從而使質(zhì)子供體的p Ka值在反應(yīng)過程中發(fā)生高低交替變化.

    4 結(jié)論

    本文采用MD模擬方法研究了溶液環(huán)境下保留型與反轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶活性位點(diǎn)動態(tài)行為的差異.通過對4個典型的β-木糖苷酶的分析,獲得了反轉(zhuǎn)型酶催化殘基間的距離大于保留型酶殘基間距離的結(jié)論,與前人的發(fā)現(xiàn)相一致.令人意外的是,本工作發(fā)現(xiàn):保留型酶的質(zhì)子供體的p Ka在高低兩個定值之間交替變化,這也是保留型酶雙取代反應(yīng)得以發(fā)生的基本要求;而反轉(zhuǎn)型中質(zhì)子供體的p Ka則穩(wěn)定在某個較高值,以利于獲得水溶液中的氫離子,進(jìn)行單取代反應(yīng).另外,我們還發(fā)現(xiàn)質(zhì)子供體附近存在保守氨基酸,如組氨酸、天冬氨酸,可以通過原子間的相互作用來調(diào)節(jié)質(zhì)子供體p Ka值的動態(tài)變化,從而有可能通過改變這些位點(diǎn)的氨基酸來最終轉(zhuǎn)變酶的水解機(jī)制.這些結(jié)果進(jìn)一步闡明了保留型與反轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶催化機(jī)制間的差異,加深了對β-木糖苷酶水解機(jī)制的認(rèn)識,為后續(xù)酶的理性改造和高效利用提供具有指導(dǎo)價值的結(jié)構(gòu)與機(jī)理信息.

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    Mo lecu lar Dynam ics Sim u lation o f Ac tive-Sites o f Retaining and Invertingβ-Xy losidases

    ZHANG Jun-Wei1ZHOU Jun-Gang1,*LüHong1,2HUANG Qiang1,2,*
    (1State Key Laboratory ofGenetic Engineering,SchoolofLife Sciences,ShanghaiEngineering Research Center of Industrial M icroorganisms,Fudan University,Shanghai200433,P.R.China;2ShanghaiCollaborative Innovation Centerfor Biomanufacturing Technology,Shanghai200237,P.R.China)

    Xylans are im portantas potential renewable energy sources.In recentyears,there has therefore been interestin im proving theirdegradation efficiencies.β-Xylosidases are key enzymes for xylan degradation; these enzymes are classified,based on their hydrolysis mechanisms,as retaining or inverting enzymes. Althoughmuch research has been devoted to understanding retaining and invertingmechanisms,little is known about their differences in solution.We used molecular dynam ics(MD)simulations w ith explicit solvent representation to study the dynam ic behaviors of the active-sites of four typicalβ-xylosidases by analyzing the distances between two catalytic am ino acids and the p Kavalues ofproton-donoram ino acids.The results show that the distance between the catalytic am ino acidswith inverting enzymes is about0.8-1.0 nm,which is greater than that for retaining enzymes,i.e.,0.5-0.6 nm.This is consistentw ith previous results based on the crystal structures ofglycosidases.We found that the p Kaof the retaining proton donors aremodulated by interactions w ith neighboring am ino acids,enabling sw itching between low and high values.Such a p Kasw itch is neededfor the double-disp lacementmechanism of retaining enzymes.In contrast,inverting proton donors,modulated by interactions w ith neighboring glutam ic acids,have only high p Kavalues.Thismay be im portant in proton capture from the solventby donors,andmay facilitate the single-displacementmechanism of inverting enzymes. This study provides new insights into the hydrolysismechanisms ofβ-xylosidases,and w illtherefore be useful in improving the efficiency and app lications ofβ-xylosidases.

    β-Xylosidase;Catalyticmechanism;Molecularmodelling;Proton donor;p Kavalue

    O643;Q71

    icle]

    10.3866/PKU.WHXB201504151 www.whxb.pku.edu.cn

    Received:February 16,2015;Revised:April13,2015;Published onWeb:April15,2015.

    ?Corresponding authors.HUANG Qiang,Email:huangqiang@fudan.edu.cn;Tel:+86-21-51630589.ZHOU Jun-Gang,Email:zhoujg@fudan.edu.cn; Tel:+86-21-51630578.

    The projectwassupported by the ShanghaiNaturalScience Foundation,China(13ZR1402400)and NationalNatural Science Foundation of China (31200022).

    上海市自然科學(xué)基金(13ZR1402400)及國家自然科學(xué)基金(31200022)資助項(xiàng)目

    ?Editorialofficeof Acta Physico-Chim ica Sinica

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