辛伐他汀對慢性阻塞性肺病大鼠血漿及肺泡灌洗液中5－羥色胺表達的影響

辛伐他汀對慢性阻塞性肺病大鼠血漿及肺泡灌洗液中5-羥色胺表達的影響

王雅杰姜雪張立海王麗紅袁林棟孫武裝

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院呼吸內科，河北石家莊050031)

摘要〔〕目的觀察5-羥色胺(HT)在吸煙誘導的慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠血漿及肺泡灌洗液中的表達，探討5-HT在COPD發(fā)病中的作用及辛伐他汀對其影響。方法①采用煙熏法建立COPD大鼠模型。將30只大鼠隨機分為三組：對照組、煙霧暴露組、辛伐他汀組各10只。自煙霧暴露之日起辛伐他汀組給予辛伐他汀(5 mg/kg)，于煙霧暴露前灌胃，每日一次。16 w后，測量體重、肺動脈壓(PAP)、肺功能，并對肺組織病理形態(tài)學進行觀察。②采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測5-HT在COPD大鼠血漿及肺泡灌洗液中的含量，觀察辛伐他汀對其表達的影響。結果①三組實驗前體重無明顯差異(P>0.05)。實驗結束時，煙霧暴露組體重較對照組明顯下降(P<0.01)；辛伐他汀組體重較煙霧暴露組升高(P<0.05)。②與對照組比較，煙霧暴露組平均內襯間隔(MLI)明顯增加(P<0.01)，平均肺泡數(shù)(MAN)明顯降低(P<0.01)；辛伐他汀治療后 MLI降低(P<0.05)，MAN增加(P<0.01)。③相對于對照組，煙霧暴露組動態(tài)肺順應性(Cdy)、用力呼氣容積(FEV)0.3/用力呼氣量(FVC)明顯下降(P<0.05)，呼氣相氣道相應阻力(Re)、吸氣相氣道相應阻力(Ri)升高(P<0.05)；辛伐他汀組治療后Re、Ri、FEV0.3/FVC、Cdy相對于煙霧暴露組均有改善(P<0.05)。與對照組比較，煙霧暴露組和辛伐他汀組mPAP明顯升高(P<0.05)。辛伐他汀治療后mPAP明顯降低(P<0.05)。④三組右心和左心室、室間隔重量比〔RV/(LV+S)〕值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，煙霧暴露組RV/(LV+S)增大(P<0.05)；辛伐他汀組治療后RV/(LV+S)降低(P<0.05)。⑤與對照組比較，煙霧暴露組及辛伐他汀組血漿及肺組織中5-HT較對照組明顯升高(P<0.05)。肺泡灌洗液中5-HT水平無明顯變化(P>0.05)。辛伐他汀組治療后血漿及肺組織中5-HT降低(P<0.05)，肺泡灌洗液中5-HT水平無明顯變化(P>0.05)。⑥5-HT 在血漿中及肺組織中的表達與右心室肥厚指數(shù)(RVHI)呈正相關(r=0.702，0.543，P=0.000，0.002)，與mPAP呈正相關(r=0.772，0.821，P=0.000)。結論①大鼠香煙煙霧暴露16 w建立COPD模型成功。②5-HT在COPD發(fā)生、發(fā)展過程中有明顯的變化及聯(lián)系，在COPD發(fā)生發(fā)展中起重要作用。辛伐他汀可能是治療COPD有效的方法之一。

關鍵詞〔〕慢性阻塞性肺??；吸煙；5-HT；辛伐他汀

中圖分類號〔〕R563.3〔

通訊作者：孫武裝(1966-)，男，主任醫(yī)師，博士，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

第一作者：王雅杰(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺病研究。

世界銀行/世界衛(wèi)生組織的資料表明，至2020年慢性阻塞性肺疾病(COPD)將位居世界疾病經(jīng)濟負擔的第五位，到2020年COPD將位居全球死亡原因的第三位〔1〕。目前一致認為其主要病理改變?yōu)闅獾?、肺實質和肺血管的慢性炎癥，發(fā)展到晚期可出現(xiàn)肺動脈高壓(PAH)、肺源性心臟病等并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)5-羥色胺(HT)與呼吸系統(tǒng)疾病有密切關系(如阻塞性睡眠呼吸暫停〔2〕、支氣管哮喘〔3〕、PAH〔4〕等)。血液中5-HT主要儲存于血小板中，當受到炎癥反應、低氧等因素刺激時，血小板大量釋放5-HT，從而引起一系列的病理生理反應。有學者認為，5-HT與肺血管平滑肌上多種受體結合可引起肺血管收縮〔6〕及肺血管平滑肌細胞(PASMC)增殖〔7〕。他汀類藥物即三羥基三甲基戊二酰輔酶A(HMG-CA)。還原酶抑制劑通過降低血脂，減少降低心血管事件發(fā)生的防治效果，已經(jīng)得到證實。近年來，人們越來越關注他汀類藥物的非降脂作用：主要包括抑制平滑肌細胞的增殖、黏附和遷移，改善血管內皮功能，抗炎抗氧化，免疫調節(jié)，抗血栓形成，穩(wěn)定動脈硬化粥樣斑塊及可能的抗心律失常，抗腫瘤，抗骨質疏松等。本研究擬揭示在COPD病理狀態(tài)下5-HT水平變化及辛伐他汀對其的影響。

1材料與方法

1.1動物分組與模型建立采用宋一平等〔8〕煙熏方法制作大鼠COPD PAH模型，雄性健康SD大鼠30只，體重(100±10)g，6周齡，河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，平均隨機分為3組：對照組、煙霧暴露組、辛伐他汀組各10只。各組平均體重差異無統(tǒng)計學意義。采用被動煙熏法建立COPD PAH大鼠模型：煙霧暴露組及辛伐他汀組每日在熏煙箱內給予煙霧干預，每次吸煙20支(鉆石牌香煙)，每次吸煙1 h，2次/d，日間兩次吸煙間隔4～5 h，共16 w，并同時給予辛伐他汀組(5 mg/kg)灌胃干預，1次/d。

1.2肺功能測定飼養(yǎng)16 w后，測量大鼠體重，用1%苯巴比妥(50 mg/kg)經(jīng)腹腔內注射麻醉，切開氣管、插入氣管插管(為一靜脈針去針頭的塑料軟管)，將大鼠放入動物肺功能儀中(北京蘭博科技有限公司)，接壓力傳感器，設置基本吸呼比及氣道壓力，進行肺功能測試。監(jiān)測大鼠8個自主呼吸周期，記錄肺氣道壓力，肺容積的變化，計算出呼氣相氣道相應阻力(Re)、吸氣相氣道相應阻力(Ri)。通過三通管向肺內輸注6 ml空氣使大鼠被動深呼吸，隨即測定用力呼氣量(FVC)和用力呼氣容積(FEV)0.3，并計算FEV0.3/FVC。

1.3支氣管肺泡灌洗液(BALF)及外周血、肺標本的采集解剖暴露心肺，將3 ml生理鹽水經(jīng)氣管插管緩慢注入左肺，停留20 s后再回抽，反復3次(回收率70%～80%)，將BALF注入無菌離心管內，混勻。剪取右肺前三個肺葉，放入液氮中儲存；剪取右肺剩余的一個肺葉放入裝有甲醛的廣口瓶中(待以后病理形態(tài)學檢查用)。

1.4HE染色中性甲醛固定后脫水、石蠟包埋常規(guī)病理學切片HE染色，電鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學變化，應用日本Olympus顯微鏡，BHEC顯微鏡彩色圖像處理系統(tǒng)觀察肺組織病理形態(tài)并測量：①平均內襯間隔(MLI)：在顯微鏡視野中央劃一十字交叉線，計算交叉線相交的所有肺泡隔數(shù)(NS)，然后計算十字線總長度(L)，MLI=L/NS。該指標反映肺泡平均內徑的大小。②平均肺泡數(shù)(MAN)：精確計數(shù)每個視野中的肺泡數(shù)(Na)，并計算出每個視野的面積(S)，MAN=Na/S，算出每個視野的每mm2平均肺泡數(shù)，該指標反映肺泡密度大小。

1.55-HT的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測5-HT的含量，具體按照廠家說明書進行。第一單抗為美國Abnova公司，5-HT檢測靈敏度為5 ng/ml，檢測批內誤差均<10%，批間誤差<15%。酶標儀產(chǎn)自美國BIO-TEK型號：ELx800。

1.6測量平均肺動脈壓(mPAP)和左右心室比值參照孫波等〔9〕的方法。所有大鼠分離右頸外靜脈，經(jīng)右頸外靜脈行右心插管，進行 mPAP 測定，導管另一端經(jīng)壓力換能器與多道生理記錄儀(四川成都儀器廠)連接并記錄mPAP。處死大鼠后，完整取出心臟，濾紙吸水后分別稱重，測右室(RV)游離壁及左室和室間隔(LV+S)的質量，計算右心和左心室、室間隔重量比(RVHI)=RV/(LV+S)比值，以此作為判斷大鼠右室肥大的指標，并以此作為間接反映肺動脈壓力的指標。

1.7統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，t檢驗，Logistic回歸分析。

2結果

2.1大鼠體重實驗前3組體重無顯著差異(P>0.05)。實驗結束后，煙霧暴露組及辛伐他汀組體重較對照組明顯下降(P<0.01)；辛伐他汀組治療后體重較煙霧暴露組明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.2大鼠肺組織病理學變化對照組大體肺組織標本光滑、紅潤、平整、有彈性。顯微鏡下觀察氣管壁及肺泡清晰，無炎性細胞浸潤。氣道上皮的纖毛規(guī)整，肺泡間隔正常，未見肺大皰。與對照組比較，煙霧暴露組大體肺組織標本體積增大，外表粗糙，顏色蒼白，彈性差。鏡下觀察氣管壁較對照組增厚、管腔變窄，氣道上皮的纖毛排列紊亂、局部纖毛脫落。小血管及細支氣管壁周圍均有大量炎性細胞浸潤；肺泡壁變薄，形成肺大皰。辛伐他汀組肺臟較煙霧暴露組肺組織稍有縮小。肺泡壁稍變薄，肺泡腔略減小，仍有肺氣腫改變，但較煙霧暴露組局限，氣管壁及小血管周圍炎性細胞浸潤減少，主要以局限性肺氣腫樣改變?yōu)橹?，纖毛排列紊亂及脫落現(xiàn)象較煙霧暴露組減輕。見圖1。與對照組比較，煙霧暴露組MLI 明顯增加(P<0.01)，MAN明顯降低(P<0.01)；與煙霧暴露組比較，辛伐他汀組 MLI降低(P<0.05)，MAN增加(P<0.01)。見表2。

表1　煙霧暴露前后3組體重的變化

與對照組比較：1)P<0.01；與煙霧暴露組比較：2)P<0.05；表2、4同

圖1　各組肺組織病理HE染色(×400)

分組MLI(μm)MAN(個/mm2)對照組41.274±2.737381.051±35.756煙霧暴露組97.803±6.9941)170.606±29.5991)辛伐他汀組90.701±6.8411)2)201.373±30.4331)2)F/P值275.617/0.000125.810/0.000

2.3mPAP和RVHI與對照組比較，煙霧暴露組和辛伐他汀組mPAP明顯升高(P<0.01)。與煙霧暴露組比較，辛伐他汀組mPAP明顯降低(P<0.01)。與對照組比較，煙霧暴露組RVHI顯著增大(P<0.01)；與煙霧暴露組比較，辛伐他汀組RVHI顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3　3組mPAP、RVHI比較 ± s， n=10)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與煙霧暴露組比較：3)P<0.01

2.4肺功能與對照組比較，煙霧暴露組動態(tài)肺順應性(Cdy)、FEV0.3/FVC顯著下降(均P<0.01)，Re、Ri顯著升高(均P<0.01)；而與煙霧暴露組比較，辛伐他汀組Re、FEV0.3/FVC、Cdy均有改善(均P<0.05)，Re、Ri有所下降(均P<0.05)。見表4。

表4　3組肺功能比較

2.55-HT的測定結果與對照組比較，煙霧暴露組及辛伐他汀組血漿及肺組織中5-HT明顯升高(P<0.01)。BALF 5-HT水平無明顯變化(P>0.05)。與煙霧暴露組比較，辛伐他汀組血漿及肺組織中5-HT明顯降低(P<0.01)，BALF 5-HT水平無明顯變化(P>0.05)。見表5。

2.6相關性分析5-HT 在血漿中及肺組織中的表達與RVHI呈正相關(r=0.702，0.543；P=0.000，0.002)，與mPAP呈正相關(r=0.772，0.821；P均=0.000)。

表5　3組血漿及肺組織中5-HT的表達

與對照組比較：1)P<0.01；與煙霧暴露組比較：2)P<0.01

3討論

COPD的發(fā)生、發(fā)展與肺臟對有害氣體或顆粒的異常炎癥有關〔10〕，而導致COPD發(fā)生的最重要危險性因素是煙草〔11，12〕。香煙煙霧中尼古丁、氧自由基、焦油等有害物質對肺臟產(chǎn)生的局部炎癥反應及大量的氧自由基對肺部產(chǎn)生氧化應激反應，兩者相互影響、相互促進，在COPD發(fā)病中共同發(fā)揮著重要作用。激活的炎癥細胞釋放多種炎癥細胞因子，如白三烯、腫瘤壞死因子(TNF)-α白細胞介素(IL)等，引起氣道及肺實質反復損傷，從而導致肺泡壁、氣道壁的結構破壞和重塑〔13〕。隨著病程發(fā)展，損傷和修復過程循環(huán)發(fā)生，逐漸出現(xiàn)肺血管重構、PAH產(chǎn)生及肺心病形成。

辛伐他汀通過競爭性抑制HMG-CoA還原酶，阻斷膽固醇生成，對心血管保護作用超出單純降脂作用，這與其抗增殖、抗炎性作用和改善內皮細胞功能密切相關〔14～18〕。Lee等〔19〕采用煙熏(10支/d，連續(xù)16 w)誘導的大鼠肺氣腫、PAH模型，辛伐他汀干預組(5 mg·kg-1·d-1)明顯抑制煙熏誘導的肺動脈壓力增高，減輕煙熏引起的肺小動脈肌型化，對肺血管周圍炎癥細胞浸潤有明顯抑制作用。近年數(shù)項研究報道他汀類藥物可改善PAH大鼠肺血流動力學和肺血管重構改變〔20～25〕。本研究驗證了上述理論。

5-HT是體內一個重要的絲裂素，它能促進肺血管平滑肌增生，肺動脈血管收縮和局部微血栓形成〔26〕。本文說明在COPD PAH大鼠模型中，5-HT高表達與肺動脈壓力升高是相關的。他汀類藥物對COPD PAH大鼠具有治療作用。COPD PAH大鼠模型中，5-HT能夠促進右心室肥厚。他汀類藥物對右心室?guī)缀螛嬓偷母淖円灿幸欢ǖ谋Ｗo作用。野百合堿注射的大鼠模型中，他汀類藥物能明顯改善大鼠血流動力學參數(shù)及抑制5-HT的表達，推測他汀類藥物對野百合堿誘導的大鼠PAH的治療作用與其抑制5-HT的表達可能有關〔27，28〕，此結論與本研究結果有相似之處。

綜上，COPD大鼠肺組織及血漿中5-HT高表達促進肺血管重構，而辛伐他汀通過緩解肺血管重構來降低肺動脈壓力，而辛伐他汀是否能用于臨床，還需要基礎實驗研究。

4參考文獻

1Global initiative for chronic obstructive lung disease.Global strategy of the diagnosis，management and prevention of chronic obstructive pulmonary disease，revised 2013(Online).“The global initiative for chronic obstructive lung disease.”〔EB/OL〕http：//www.goldcopd.org/guidelines-global-strategy-fordiagnosis-managemet.html

2Ling L.Serotonin and NMDA receptors in respiratory long-term facilitation〔J〕.Respir Physiol Neurobiol，2008；164(1-2)：233-41.

3Pretorius E.The role of serotonin and cholesterol in asthma〔J〕.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psych，2009，33(5)：910-1.

4Maclean MR，Dempsie Y.The serotonin hypothesis of pulmonary hypertension revisited〔J〕.Adv Exp Med Biol，2010；661：309-22.

5Menard G，Turmel V，Bissonnette EY.Serotonin modulates the cytokine network in the lung：involvement of prostaglandin E2〔J〕.Clin Exp Immunol，2007；150(2)：340-8.

6Kaumann AJ，Levy FO.5-hydroxytryptamine receptor in the human cardiovascular system〔J〕.Pharmacol Ther，2006；111(3)：674-706.

7Kenneth EW，Hong ZG，Varghese A.The serotonin transporter a vehicle to elucidate pulmonary hypertension〔J〕.Circ Res，2004；94(9)：1263-70.

8宋一平，崔德鍵，茅培英，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道重塑及生長因子的研究〔J〕.中華結核和呼吸雜志，2001；24(5)：283-7.

9孫波，劉文利.右心導管測定大鼠肺動脈高壓的實驗方法〔J〕.中國醫(yī)學科學院學報，1984；6(6)：465-7.

10GOLD.Global strategy for the diagnosis，management and prevention of chronic obstructive pulmonary disease.Revised 2006，www.goldcopd.org

11Ezzati M，Lopez AD.Estimates of global mortality attributable to smoking in 2000〔J〕.Lancet，2003；362(9387)：847-52.

12Van Schayck CP，Eloozen JM，Wagena E，etal.Detecting patienis at a high risk of developing chronic obstructive pulmonary disease in general practice：cross sectional case finding study〔J〕.BMJ，2002；324(7350)：1370.

13Sparrow CP，Burton CA，Hernandez M，etal.Simvastatin has anti-imflammation and antiatherosclerotic activities independent of plasma cholesterol lowering〔J〕.Arteriosecler Thromb Vasc Biol，2001；21(1)：115-21.

14Kwak B，Mulhaupt F，Myit S，etal.Statins as a newly recognized type of immunomodulator〔J〕.Nat Med，2000；6(12)：1399-402.

15Frenette PS.Loecking a leukocyte integrin with statins〔J〕.N Engl J Med，2001；345(19)：1419-21.

16Marz W，Koenig W.HMG-CoA reductase inhibition：anti-inflammatory effects beyond lipid lowering〔J〕. J Cardiovasc Risk，2003；10(3)：169-79.

17Schonbeck U，Libby P.Inflammation，immunity and HMG-CoA reductase inhibitors：statins as anti-inflammatory agents〔J〕. Circulation,2004；109(21 Suppl 1)：1118-26.

18Ridker PM，Rifai N，Pfeffer MA,etal.Inflammation pravastatin and the risk of coronary events after myocardial infarction in patients with average cholesterol levels.Cholesterol and Recurrent Events(CARE)Invesigators〔J〕.Circulation，1998；98(9)：839-44.

19Lee JH，Lee DS，Kim EK,etal.Simvastatin inhibits cigarette smoking-induced emphysema and pulmonary hypertension in rat lungs〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2005；172(8)：987-93.

20Nishimura T，Vsazar LT，F(xiàn)aul JL，etal.Simvastatin rescues rats from fatal pulmonary hypertension by inducing apoptosis of neointimal smooth muscle cells〔J〕.Circulation，2003；108(13)：1640-5.

21Nishimura T，F(xiàn)aul JL，Berry GJetal.Simvastatin attenuaites smooth muscle neointimal proliferation and pulmonary hypertension in rats〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2002;166(10)：1403-8.

22Murata T，Sato K，Hori M，etal.Decreased endothelial nitric-oxide synthase activity resulting from abnormal interaction between eNOS and its regulatory proteins in hypoxia-induced pulmonary hypertension〔J〕.J Bio Chem，2002；277：44085-92.

23Murata M，Kinoshita K，Hori M，etal.Statin protects endothelial nitric oxide synthase activity in hypoxia-induced pulmonary hypertension〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005；25：2335-42.

24Girgis RE，Li D，Zhan XH，etal.Attenuation of chronic hypoxic pulmonary hypertension by simvastatin〔J〕.Am J Physiol Heart Cric Physiol，2003；285：H938-45.

25Laufs U，F(xiàn)ata VL，Liao JK.Inhibition of 3-hydrioxy-3-methylalutaryl(HMG)-CoA reductase blocks hypoxia-mediated down-regulation of endothelial nitric oxide synthase〔J〕.J Bio Chem，1997；272：31725-9.

26Fanburg BL，Lee SL.A new role for an old molecule：serotonin as a mitogen〔J〕.Am J Physiol,1997；272(5 Pt 1)：L795-806.

27朱少平，毛志福，黃杰，等.氟伐他汀對肺動脈高壓大鼠 5-羥色胺轉載體表達的影響〔J〕.實用藥物與臨床，2009；12(4)：235-7.

28Miyata M，Ito M，Sasajima T，etal.Effect of a serotonin receptor antagonist on interleukin-6-induced pulmonary hypertension in rats〔J〕.Chest，2001；119：554-61.

〔2013-12-17修回〕

(編輯苑云杰)