HSD17B10、ALDH9A1、ALDH2、PRDX4在腦膜瘤蛋白質(zhì)組學(xué)中的上調(diào)表達(dá)

HSD17B10、ALDH9A1、ALDH2、PRDX4在腦膜瘤蛋白質(zhì)組學(xué)中的上調(diào)表達(dá)

崔廣強(qiáng)矯愛紅1劉愛娜1陳劍1鄒鵬劉杰陳鴻光張洪濤張?jiān)趶?qiáng)吳鑫湯國(guó)太

(煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院神經(jīng)外科，山東煙臺(tái)264000)

摘要〔〕目的探討人腦膜瘤的發(fā)病機(jī)制。方法以人腦膜瘤組織和配對(duì)瘤旁正常蛛網(wǎng)膜組織為研究材料，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選腦膜瘤相關(guān)蛋白質(zhì)。應(yīng)用GO進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果鑒定出4個(gè)具有氧化還原酶活性的上調(diào)表達(dá)蛋白。結(jié)論該研究揭示了腦膜瘤蛋白質(zhì)組中的4個(gè)具有氧化還原酶活性的上調(diào)表達(dá)蛋白，為進(jìn)一步研究腦膜瘤的發(fā)生和發(fā)展分子機(jī)制提供了初步數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞〔〕腦膜瘤；蛋白質(zhì)組學(xué)；差異蛋白 GO分析

中圖分類號(hào)〔〕R6〔

基金項(xiàng)目：煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃(2013WS214)

1煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

第一作者：崔廣強(qiáng)(1977-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腦腫瘤、腦外傷、腦血管疾病研究。

在生命科學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，只有2%的疾病是由基因序列決定的，而98%的疾病發(fā)生與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)〔1〕。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)于揭示疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本10例新鮮人腦膜瘤組織及其配對(duì)的瘤旁正常蛛網(wǎng)膜組織取自煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院神經(jīng)外科的未經(jīng)放療、化療的腦膜瘤手術(shù)切除標(biāo)本，并經(jīng)病理診斷確診均為WHO I級(jí)。腫瘤組織來(lái)源患者情況：年齡42～70歲，平均55歲；男4例，女6例。實(shí)驗(yàn)操作得到倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑和主要實(shí)驗(yàn)儀器試劑：過硫酸銨、Tris等購(gòu)自上海生工；二氟乙酸(TFA)購(gòu)自于Fluka，羥基內(nèi)桂酸(CHCA)質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)品多肽購(gòu)自Sigma公司；ACN購(gòu)自Fisher公司；胰酶購(gòu)自Promega(Madison，WI，USA)，固相pH梯度(IPG)膠條等購(gòu)自美國(guó)通用電器(GE Healthcare)公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器：等電聚焦電泳儀(Ettan IPGphor Ⅱ，GEHealthcare)；垂直電泳儀(Ettan DALT twelve，GEHealthcare)；凝膠掃描儀(PowerLook2100XL，Umax)；凝膠圖像分析軟件(PDquest，Biorad)；基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(ABI 4700，ABI)。

1.2方法

1.2.1組織標(biāo)本的處理手術(shù)切除的腦膜瘤樣本10例及其配對(duì)的瘤旁正常蛛網(wǎng)膜組織。手術(shù)切取后，去除血塊、纖維組織等，即刻放入液氮中，然后轉(zhuǎn)入-80℃保存。

1.2.2組織總蛋白制備將腦膜瘤和正常腦膜組織剪碎，使用GE Healthcare公司的“Sample grinding kit”研磨樣品。

1.2.3蛋白定量根據(jù)定量蛋白濃度，將所有腦膜瘤和正常腦膜分別等量混合，組成腦膜瘤和正常腦膜樣品的樣本池。蛋白純化：加入相當(dāng)于4倍體積的丙酮，緩慢混勻，在冰上靜置2 h，使蛋白充分沉淀，4℃，12 000 r/min離心10 min；棄上清，并加入適量的普通雙向裂解液，緩慢溶解2 h，12 000 r/min離心30 min，得到的上清為純化后蛋白樣品。

1.2.4雙向電泳第一向等電聚焦電泳(IEF)：樣品500 μg與水化液混合，膠內(nèi)溶脹上樣，予20℃進(jìn)行在Ettan IPGphor Ⅱ上進(jìn)行等電聚焦電泳。平衡：完成等電聚焦后，分別把 IPG 膠條置入15 ml含有1%(W/V)二硫蘇糖醇(DTT)平衡液中，振蕩15 min。再把膠條放入15 ml含有2.5%碘乙酰胺(IAA)(W/V)的平衡液中烷基化15 min。 第二向十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺酸膠(SDS-PAGE)電泳：IPG膠條平衡后移至12.5%的均一凝膠上方，用含溴酚藍(lán)的0.5%瓊脂糖封頂。采用Ettan DALT twelve進(jìn)行SDS-PAGE，電泳參數(shù)：第一步恒功率0.2 W/膠，1 h；第二步恒功率0.4 W/膠，1 h；第三步250 V恒壓5 h，至溴酚藍(lán)指示線跑至膠底緣時(shí)電泳結(jié)束。

1.2.5凝膠染色以考馬斯亮藍(lán)R350染色。配置儲(chǔ)存液，在磁力攪拌器中攪拌，加速溶解5～10 min，加120 ml甲醇繼續(xù)攪拌，至徹底溶解，終體積為200 ml，然后在通風(fēng)櫥中過濾。過濾好以后把染色儲(chǔ)液存于4℃冰箱，使用前以20%乙酸1∶1配比，搖勻后即可以使用。染色時(shí)間需在24 h以上，去掉染色液后使用脫色液清洗凝膠數(shù)遍后即可獲得背景清晰的染色效果。

1.2.6凝膠圖像掃描和分析使用PowerLook 2100XL掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行透射掃描，在300 dpi的分辨率下掃描凝膠從而獲得圖像。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，用PDQuest 7.0凝膠圖像分析軟件依次進(jìn)行凝膠點(diǎn)的檢測(cè)、背景消減、匹配、歸一化等各項(xiàng)分析。差異位點(diǎn)定義為各組間相對(duì)豐度差異2倍以上的位點(diǎn)。

1.2.7蛋白膠點(diǎn)的酶解首先使用槍頭將膠點(diǎn)進(jìn)行垂直切取，然后進(jìn)行酶解。37℃水浴中將膠粒浸泡于脫色工作液中進(jìn)行脫色，至膠粒藍(lán)色褪盡。然后用100%乙腈脫水15 min，離心干燥10 min。再加胰蛋白酶溶液于4℃吸脹30 min。把多余的胰酶吸出后，加10 μl 25 mmol/L NH4HCO3于37℃酶解過夜。酶解完成后，首先用萃取液抽提肽段，于37℃保溫1 h， 再將萃取的上清液轉(zhuǎn)入到新的EP管中，離心機(jī)濃縮干燥。使用3 μl溶解液溶解干燥好的肽段，再進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.8質(zhì)譜鑒定肽指紋圖譜(PMF)數(shù)據(jù)采集在ABI 4700飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行，質(zhì)量范圍為800～3 500 D，激光能量設(shè)置在4 000，每個(gè)質(zhì)譜圖由20個(gè)各含100次激光轟擊的圖譜合成。采用GPS Explorer 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其核心算法為MASCOT，檢索時(shí)設(shè)定質(zhì)量范圍為800～3 500 D，圖譜密度為每200 D不超過50個(gè)峰，信噪比20，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為SWISS-PROT，peptide tolerance設(shè)置0.15 D。

1.2.9質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)分析采用PDQuest 7.0軟件分析腦膜瘤組織和正常蛛網(wǎng)膜組織2-D 凝膠之間的差別。利用其注釋功能凝膠圖像上點(diǎn)的蛋白質(zhì)有關(guān)信息進(jìn)行注釋。

1.3GO數(shù)據(jù)分析應(yīng)用molecul annotation system 3.0軟件進(jìn)行GO數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果

本研究直接針對(duì)腦膜瘤組織，比較腦膜瘤組織和瘤旁正常蛛網(wǎng)膜組織蛋白表達(dá)差異，鑒定出26個(gè)在腦膜瘤組織上調(diào)表達(dá)蛋白：3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2，Peroxiredoxin-4，Aldehyde dehydrogenase，4-trimethylaminobutyraldehyde dehydrogenase，BTB/POZ domain-containing protein KCTD12，Chloride intracellular channel protein 1，Cofilin-1，Cytochrome b-c1 complex subunit 1,Glutathione S-transferase P，Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H，Hypoxia up-regulated protein 1，POTE ankyrin domain family member F，Profilin-1，Prohibitin，Proteasome subunit alpha type-2，Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1，Phosphoglycerate kinase 1，40S ribosomal protein S12，Carbonic anhydrase 1，Phosphoglycerate mutase 1，Triosephosphate isomerase，N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1，Phenazine biosynthesis-like domain-containing protein，Rho GDP-dissociation inhibitor 1，Tropomyosin alpha-4 chain，Glycine amidinotransferase。應(yīng)用molecul annotation system 3.0軟件對(duì)上調(diào)表達(dá)蛋白進(jìn)行GO數(shù)據(jù)分析，得到4個(gè)具有氧化還原酶活性的上調(diào)表達(dá)蛋白，分別為HSD17B10;ALDH9A1;ALDH2;PRDX4，P<0.05。見表1。

表1　四個(gè)具有氧化還原酶活性的上調(diào)表達(dá)蛋白的基本數(shù)據(jù)

3討論

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種廣泛的蛋白表達(dá)譜掃描技術(shù)，可以解釋細(xì)胞或組織中差異表達(dá)蛋白和特異性表達(dá)蛋白。近年來(lái)，一些研究證明特異的蛋白質(zhì)組和蛋白表達(dá)方式可以區(qū)分人類腦部腫瘤的不同亞型和等級(jí)〔2〕。腦膜瘤起源于蛛網(wǎng)膜細(xì)胞，是顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率最高的腫瘤之一。一般為良性，但是如果得不到有效的控制，會(huì)侵入腦組織，造成預(yù)后惡化的風(fēng)險(xiǎn)〔3〕。近年來(lái)，腦膜瘤分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方面的研究為人們提供了揭示腦膜瘤形成和發(fā)展分子機(jī)制的新途徑〔4〕。

Tao等〔5〕收集選擇了79例腦膜瘤手術(shù)患者的腦膜瘤組織，采用cDNA或組織微陣列技術(shù)對(duì)腦膜瘤的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了研究，分析差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)其與血管發(fā)生、增殖和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路有關(guān)。這些差異表達(dá)基因會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活失衡，誘發(fā)腫瘤發(fā)生。Kim等〔6〕收集了4例腦膜瘤和4例非腦膜瘤病人的腦脊液，采用雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定出了11個(gè)蛋白，其中Apo E、Apo J和AAT在腦膜瘤組織是上調(diào)表達(dá)，PTGDS、TTR和β2M在腦膜瘤組織下調(diào)表達(dá)。 這些蛋白可能是腦膜瘤的候選生物標(biāo)記。

將這些蛋白應(yīng)用molecul annotation system 3.0軟件進(jìn)行GO數(shù)據(jù)分析，得到4個(gè)具有氧化還原酶活性的上調(diào)表達(dá)蛋白。3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 又名17-β-Hydroxysteroid dehydrogenase X，是由HSD17B10(hydroxysteroid (17β) dehydrogenase 10)基因編碼〔7〕。該蛋白是短鏈脫氫酶/還原酶超家族成員，是一個(gè)線粒體酶，可以催化多種脂肪酸、乙醇和類固醇的氧化〔8〕，與阿爾茨海默病的發(fā)展相關(guān)。抑制該蛋白表達(dá)會(huì)導(dǎo)致hydroxysteroid (17β) dehydrogenase X (HSD10)缺乏、心智發(fā)育遲緩、舞蹈手足徐動(dòng)癥和異常行為等〔9〕。本研究結(jié)果提示該蛋白與腦膜瘤的發(fā)生和發(fā)展可能相關(guān)。

4-trimethylammoniobutyraldehyde dehydrogenase是催化化學(xué)反應(yīng)4-trimethylammoniobutanal + NAD++ H2O 4-trimethylammoniobutanoate + NADH+2H+的酶。該酶屬于氧化還原酶家族，參與賴氨酸降解和肉毒堿的生物合成〔10〕。本研究結(jié)果顯示該蛋白可能與腦膜瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。

Aldehyde dehydrogenase是一類催化醛類氧化(脫氫)的酶〔11〕。該基因參與許多生物學(xué)過程，如清除外源和內(nèi)源產(chǎn)生的醛類。它是一個(gè)多態(tài)酶，在醛類氧化成羧酸的過程中發(fā)揮重要作用。羧酸在肝臟中合成，在肌肉和心臟中被代謝〔12〕。該酶在許多組織中都有表達(dá)，在肝臟中的含量最高〔13〕。Yokoyama等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)降低該酶的活性會(huì)導(dǎo)致食管癌的發(fā)病率增加。本研究發(fā)現(xiàn)該酶在腦膜瘤組織中表達(dá)上調(diào)，提示該酶在不同類型腫瘤中發(fā)揮不同的作用。

Peroxiredoxin-4是由PRDX4基因編碼〔15〕。該蛋白是抗氧化物酶，屬于peroxiredoxin家族。該蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中，可以還原過氧化氫和烷基氫過氧化物，使其變成水和乙醇。有研究表明該蛋白可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的激活〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在腦膜瘤組織中上調(diào)表達(dá)，提示其在腦膜瘤發(fā)生和發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了4個(gè)具有氧化還原酶活性的上調(diào)表達(dá)蛋白。但要明確上述蛋白質(zhì)是否是與腦膜瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的特異蛋白質(zhì)，還需進(jìn)一步深入研究這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)為研究腦膜瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供了初步數(shù)據(jù)。

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〔2013-11-10修回〕

(編輯袁左鳴)