不同粒徑納米二氧化鈦對小鼠抗氧化能力的損傷作用

牛林紅，董會臺，楊麗莉，宋 波，張 榮，牛玉杰*

(1.河北省石家莊市職業(yè)病防治院健康檢查科，河北石家莊050031;2.河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學教研室，河北石家莊050017)

不同粒徑納米二氧化鈦對小鼠抗氧化能力的損傷作用

牛林紅1，董會臺1，楊麗莉1，宋 波2，張 榮2，牛玉杰2*

(1.河北省石家莊市職業(yè)病防治院健康檢查科，河北石家莊050031;2.河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學教研室，河北石家莊050017)

目的觀察50 nm和120 nm二氧化鈦(titanium dioxide，TiO2)對小鼠抗氧化能力的損傷作用。方法 48只健康雄性昆明種小鼠隨機分為對照組(四蒸水)、50 nm TiO2組(5 g/kg)、120 nm TiO2組(5 g/kg)，灌胃染毒7 d，測定血清、肝、腎、皮層、海馬組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathine peroxidase，GSH-Px)活性。結(jié)果50 nm TiO2和120 nm TiO2染毒后，小鼠各組織MDA含量除120 nm TiO2組皮層外，均明顯高于對照組(P＜0.05);SOD活性除120 nm TiO2組血清外，均明顯低于對照組(P＜0.05或＜0.01);而GSH-Px活性均明顯低于對照組(P＜0.05或＜0.01);50 nm TiO2組肝臟、腎臟、海馬中的GSH-Px活性、皮層和海馬中的SOD活性明顯低于120 nm TiO2組(P＜0.05)。結(jié)論50 nm TiO2和120 nm TiO2經(jīng)口急性染毒后可使小鼠肝臟、腎臟、皮層和海馬細胞中MDA含量增加、SOD和GSH-Px活性降低，使小鼠抗氧化能力受損，但尚不能得出隨TiO2粒徑減小其損害作用增加的結(jié)論。

二氧化鈦;毒性實驗;小鼠

納米顆粒是指直徑＜100 nm并出現(xiàn)納米效應的顆粒。納米二氧化鈦(nanoparticle titanium dioxide，Nano-TiO2)因其具有優(yōu)越的熱磁、光敏感性、表面穩(wěn)定性、擴散和力學等性能，廣泛應用于涂料、污水凈化、空氣凈化、化妝品、食品包裝及生物醫(yī)藥等領域［1］。在生產(chǎn)和使用過程中Nano-TiO2可能進入人體危害人體健康，因而對其安全性評價及健康損害效應越來越受到關注。多項研究發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2具有遺傳毒性、神經(jīng)毒性、心臟毒性、呼吸毒性等［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)Nano-TiO2可使 HepG2細胞受損，損害細胞的抗氧化功能［4］;小鼠消化道暴露Nano-TiO2后，可使小鼠肝臟、腎臟、腦細胞中活性氧生成增加［5］。有研究顯示，食品級二氧化鈦(titanium dioxide，TiO2)原料中有36%的顆粒處于納米尺度［6］，從口香糖中提取的TiO2，93%的顆粒直徑處于納米尺度［7］。說明Nano-TiO2存在著經(jīng)消化道進入體內(nèi)的可能，目前Nano-TiO2的毒性研究多采用呼吸染毒，經(jīng)口毒性研究相對較少。因此，本研究選用50 nm和非常接近納米級別的120 nm TiO2為實驗材料，采用消化道染毒方法，觀察急性染毒后對小鼠肝、腎、腦等組織抗氧化能力的損傷作用，旨在為進一步揭示氧化應激在Nano-TiO2毒性機制中的作用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TiO2購自浙江弘晟材料科技股份有限公司，分為50、120 nm 2種規(guī)格，X線衍射測定顯示TiO2晶型為金紅石，純度分別為98.0%和99.0%。丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathine peroxidase，GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物醫(yī)學工程研究所。

1.2 動物分組和處理 健康雄性昆明種小鼠48只(河北省實驗動物中心提供，合格證號:醫(yī)動字第703046號)，體質(zhì)量17～22 g，隨機分為對照組(四蒸水)、50 nm TiO2組(劑量5 g/kg)、120 nm TiO2組(劑量5 g/kg)，每組16只。染毒前，動物隔夜禁食，按照每組劑量，將Nano-TiO2溶于四蒸水中，配制成125 g/L的懸濁液，充分混勻。灌胃前用超聲波清洗器37℃超聲30 min，按0.1 m L/10 g體質(zhì)量的劑量，1 min內(nèi)連續(xù)灌胃達到染毒劑量，2 h后給予食物，觀察1周后進行相應項目的檢測。

1.3 MDA含量和SOD、GSH-Px活性的測定 染毒后第8天，每組取8只小鼠，迅速收集股動脈血液約1 mL，立即以3 000 r/min離心15 min，將上清移到新EP管中，-80℃保存。將小鼠斷髓處死，在冰盤上迅速剝離肝、腎和腦組織(腦組織分離出皮層和海馬)。分別在冰凍生理鹽水中漂洗，去掉表面血跡，濾紙拭干，稱質(zhì)量，加入一定量冰的生理鹽水，用玻璃勻漿器在0～4℃下制成 10%的組織勻漿，4 000 r/min離心15 min，取上清備用;用考馬斯亮藍G-250法進行蛋白質(zhì)測定。各組血清、肝、腎、皮層、海馬組織中MDA含量、SOD和GSH-Px活性的測定均按照試劑盒要求進行。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠的一般狀況 實驗過程中，各組實驗小鼠全部存活，一般狀況良好，飲水量、進食量未見明顯改變。

2.2 血清中MDA含量和SOD、GSH-Px活性的變化

50 nm TiO2組和120 nm TiO2組小鼠血清中MDA含量與對照組相比顯著升高(P＜0.05)，GSH-Px活性明顯降低(P＜0.05);50 nm TiO2組小鼠SOD活性與對照組相比明顯降低(P＜0.05)，而120 nm TiO2組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。說明Nano-TiO2可對血液系統(tǒng)的抗氧化功能產(chǎn)生損傷。見表1。

表1 Nano-TiO2對血清MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

表1 Nano-TiO2對血清MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

*P＜0.05與對照組比較(q檢驗)

組別 MDA (nmol/m L) SOD (U/m L) GSH-Px (U/mL) 6.50±1.18 126.20±11.42 554.27±31.54 50 nm組 9.87±3.15* 104.97±10.65*512.93±7.21*120 nm組 7.97±1.10* 116.03±5.14 524.50±23.71*F對照組＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 5.470 10.012 6.785P

2.3 肝臟MDA含量和SOD、GSH-Px活性的變化

50 nm TiO2組和120 nm TiO2組小鼠肝組織勻漿中MDA含量與對照組相比顯著升高(P＜0.05)，SOD和GSH-Px活性與對照組相比則顯著降低(P＜0.05或＜0.01);且50 nm TiO2組GSH-Px活性顯著低于120 nm TiO2組(P＜0.05)。說明Nano-TiO2可以導致肝組織抗氧化功能損傷。見表2。

表2 Nano-TiO2對肝臟MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

表2 Nano-TiO2對肝臟MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.01與對照組比較 △P＜0.05與50 nm組比較(q檢驗)

?

2.4 腎臟MDA含量和SOD、GSH-Px活性的變化

50 nm TiO2組和120 nm TiO2組，小鼠腎臟中MDA含量與對照組相比顯著升高(P＜0.05)，SOD和GSH-Px活性與對照組相比則顯著降低(P＜0.05或＜0.01);且50 nm TiO2組GSH-Px活性顯著低于120 nm TiO2組(P＜0.05)。說明Nano-TiO2可以導致腎臟抗氧化功能損傷。見表3。

表3 Nano-TiO2對腎臟MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

表3 Nano-TiO2對腎臟MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.01與對照組比較 △P＜0.05與50 nm組比較(q檢驗)

?

2.5 腦組織MDA含量和SOD、GSH-Px活性的變化

50 nm TiO2組小鼠皮層內(nèi)MDA含量與對照組相比顯著升高(P＜0.05)，120 nm TiO2組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義;50 nm TiO2和120 nm TiO2組皮層SOD和GSH-Px活性與對照組相比均顯著降低(P＜0.05或＜0.01)，且50 nm TiO2組SOD活性顯著低于120 nm組(P＜0.05)。見表4。

50 nm TiO2組和120 nm TiO2組小鼠腦海馬內(nèi)MDA含量與對照組相比顯著升高(P＜0.05)，而SOD和GSH-Px活性與對照組相比顯著降低(P＜0.05或＜0.01)，且50 nm組SOD和GSH-Px活性均顯著低于120 nm TiO2組(P＜0.05)。見表5。

表4 Nano-TiO2對皮層MDA、SOD和GSH-Px的影響(n=8，±s)

表4 Nano-TiO2對皮層MDA、SOD和GSH-Px的影響(n=8，±s)

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.01與對照組比較 △P＜0.05與50 nm組比較(q檢驗)

?

表5 Nano-TiO2對海馬MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

表5 Nano-TiO2對海馬MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.01與對照組比較 △P＜0.05與50 nm組比較(q檢驗)

組別 MDA (nmol/mg prot) SOD (U/mg prot) GSH-Px (U/mg prot) 17.83±1.36 258.09±11.58 114.85±27.21 50 nm組 21.20±0.92* 176.37±15.23# 79.50±10.84#120 nm組 20.57±1.76*211.30±24.04＊△ 93.58±13.61＊△F對照組＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 13.298 42.745 7.287P

3 討 論

正常情況下，機體內(nèi)部存在氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡。當機體受到外界有害因素作用時，可通過各種途徑導致自身的抗氧化系統(tǒng)受損，此時系統(tǒng)平衡被打破，機體內(nèi)部細胞產(chǎn)生氧化應激反應，引起多種損害。MDA是機體在清除自由基過程中發(fā)生脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，它的含量反映機體脂質(zhì)過氧化的速率及強度，也間接反映機體細胞受自由基攻擊損傷的程度;SOD是一種活性物質(zhì)，可消除機體在新陳代謝過程中所產(chǎn)生的自由基等有害物質(zhì)，機體受到氧自由基攻擊必然會導致過氧化物增多進而消耗過量SOD;GSH-Px主要在肝臟內(nèi)部合成，可與毒物分子及其代謝產(chǎn)物反應，降低毒物毒性，并通過氧化還原反應降低毒物過氧化能力。通過測定上述指標可以較好地反映Nano-TiO2染毒后小鼠氧化應激所處的狀態(tài)和抗氧化能力的強弱。

活性氧的生成和氧化應激反應是納米材料引起多種生物毒性效應的主要方式，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2導致的細胞毒性、心臟毒性、DNA損傷等與活性氧水平升高、抗氧化功能受損有關［3-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2可以使大鼠血清、肝、腎MDA含量增加，SOD和GSH-Px活性降低［8］; Wang等［9］研究發(fā)現(xiàn)，80和155 nm TiO2灌胃染毒后可使海馬神經(jīng)元出現(xiàn)空泡;＜25 nm TiO2使大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞出現(xiàn)不同程度的病理改變，如染色質(zhì)溶解、核固縮、細胞密度降低等［10］;體外試驗發(fā)現(xiàn)Nano-TiO2對腦膠質(zhì)細胞有毒性作用［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2消化道染毒后小鼠血清、肝、腎、皮層、海馬組織中MDA含量升高，SOD和GSH-Px活性降低。與上述研究結(jié)果一致。我們以前的研究［12］發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2處理后小鼠肝臟出現(xiàn)細胞排列紊亂、輕度水腫和空泡變性，腎小管水腫、腎小球腫大，而海馬和皮層的病理改變相對較輕，但也出現(xiàn)神經(jīng)元空泡變性和壞死;結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)的小鼠組織活性氧水平升高［5］。提示Nano-TiO2可能通過氧化損傷作用引起小鼠臟器結(jié)構(gòu)和功能的損害，充分說明氧化應激是Nano-TiO2毒性作用機制的重要組成部分。

關于納米材料粒徑與其生物學效應之間的關系，結(jié)論并不一致。常旭紅等［2］發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2暴露在一定程度上能引起大鼠的肺組織抗氧化平衡失調(diào)、病理損傷及超微結(jié)構(gòu)的改變，且同濃度的Nano-TiO2比微米 TiO2氧化損傷更嚴重;陳苘等［8］用15 nm、25 nm和200 nm TiO2經(jīng)皮膚染毒可引起大鼠氧化應激反應，且粒徑越小引起的氧化應激反應越強烈;認為TiO2的生物學效應與粒徑大小有關，粒徑越小其毒性越大。而Warheit等［13］報道納米和微米尺寸的TiO2顆粒誘發(fā)了同等程度的大鼠肺部炎癥反應和細胞損傷;魏紅英等［14］用5、10和40 nm的TiO2觀察了對細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)不同粒徑Nano-TiO2的效應之間差異無統(tǒng)計學意義。以上研究結(jié)果表明，Nano-TiO2粒徑與損傷作用之間的關系還不十分明確，存在矛盾。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50 nm TiO2組只有肝臟、腎臟、海馬中的GSH-Px活性、皮層和海馬中的SOD活性明顯低于120 nm TiO2組，而其他指標差異無統(tǒng)計學意義，尚不能得出隨TiO2粒徑減小其毒性作用增加的結(jié)論。但本研究結(jié)果提示，隨著TiO2粒徑的減小，其對小鼠抗氧化能力的損害作用確實有增加的趨勢，因此，Nano-TiO2粒徑與其損害作用之間的相關性，尚需進一步深入研究。

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(本文編輯:劉斯靜)

R99

B

1007-3205(2015)02-0184-04

2014-12-17;

2015-01-07

河北省自然科學基金項目(C2009001073)

牛林紅(1988-)，女，河北新樂人，河北省石家莊市職業(yè)病防治院醫(yī)師，從事職業(yè)性口腔疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:yjniu@hebmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.023