野生型p53-誘導的蛋白磷酸酶1過表達與膠質(zhì)瘤患者預后的關系

梁朝輝，胡福廣，趙 林，王立群，焦保華

（河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊050000）

野生型p53-誘導的蛋白磷酸酶1過表達與膠質(zhì)瘤患者預后的關系

梁朝輝，胡福廣，趙 林，王立群，焦保華*

（河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊050000）

目的 探討野生型p53－誘導的蛋白磷酸酶1（wild－type p53－induced phosphatase1，Wip1）與腦膠質(zhì)瘤患者預后相關性。方法 通過免疫組織化學方法檢測81例不同級別和類型膠質(zhì)瘤組織與15例正常腦組織中Wip1表達陽性與患者不同臨床病理類型的關系，包括性別、年齡、膠質(zhì)瘤的病理分級、腫瘤大小、腫瘤位置、KPS評分、病理分級、PCNA表達p53表達。應用Kaplan－Meier生存曲線法分析Wip1表達與患者預后的相關性。結(jié)果 Wip1在腦膠質(zhì)瘤組織的陽性表達率為55.6%（45/81），明顯高于正常腦組織的0.0%（0/15）（χ2=15.686，P＜0.01），Wip1陽性表達的膠質(zhì)瘤患者生存率低于Wip1陰性表達患者。Wip1的表達與PCNA表達呈正相關，低KPS評分、高Wip1表達和高病理分級是膠質(zhì)瘤患者預后差的危險因素。結(jié)論 Wip1在人腦膠質(zhì)瘤組織中呈高表達，與患者預后差有關。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤;蛋白磷酸酶1;預后

［Key words］glioma;protein phosphatase 1;prognosis

野生型p53－誘導的蛋白磷酸酶1（the wild－type p53－induced phosphatase1，Wip1）是一種新發(fā)現(xiàn)的原癌基因，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶 PP2C （PP2C type protein phosphatase）家族中的一員，位于人染色體17q23/q24區(qū)域。Wip1在正常小鼠細胞生長發(fā)育過程中，起重要調(diào)控作用［1］。Wip1過表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。近年來，人們相繼發(fā)現(xiàn)Wip1在神經(jīng)母細胞瘤［2］、乳腺癌［3］、卵巢癌［4］、髓母細胞瘤［5］等腫瘤中高表達，并且高表達的Wip1與乳腺癌、胃癌及胰腺癌患者的預后差密切相關［6－8］。目前，國外學者針對Wip1在人腦膠質(zhì)瘤中的研究僅限于高級別膠質(zhì)瘤表達高于低級別膠質(zhì)瘤的報道［9］，而Wip1表達與膠質(zhì)瘤患者預后的相關性尚未見報道。本研究采用免疫組織化學方法分析Wip1在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達及其與臨床病理特征之間的關系，以探討Wip1在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，旨在為膠質(zhì)瘤的臨床治療和預后判斷提供新的線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2003年12月—2005年12月于河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)外科收治的經(jīng)手術、放化療治療的腦膠質(zhì)瘤患者95例，術后6～12個月通過電話或信件進行隨訪，記錄患者生存期;12例患者失隨訪，2例非膠質(zhì)瘤原因死亡患者排除入組，將剩余81例病歷資料完整的患者作為研究對象，男性48例，女性33例，年齡6～76歲，中位年齡36.9歲;依據(jù)2007年世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類方法，包括Ⅱ級38例（其中星形細胞瘤21例，少突膠質(zhì)細胞瘤17例），Ⅲ級23例（其中間變型星形細胞瘤12例，少突膠質(zhì)細胞瘤11例），Ⅳ級20例（均為多形性膠質(zhì)母細胞瘤）。15例正常腦組織標本來自于膠質(zhì)瘤患者術中皮層造瘺或腦外傷患者行內(nèi)減壓的腦組織，男性6例 ，女性9例，年齡9～69歲，中位年齡34.3歲。2組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 材料和試劑 Wip1兔抗人多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），PCNA鼠抗人多克隆抗體，免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司），二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色劑（北京中杉金橋生物技術公司），

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色 組織常規(guī)包埋、切片，行鏈霉菌抗生素蛋白－過氧化物酶連結(jié)法（streptavidin－perosidase，SP）免疫組織化學染色，Wip1一抗（1∶200），增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（1∶200），PBS作陰性對照，Wip1染色以人正常胃組織作陽性對照。

1.3.2 評分方法 由2名及2名以上神經(jīng)病理科醫(yī)師在不知道患者臨床數(shù)據(jù)的情況下，采取雙盲法對結(jié)果進行計數(shù)。在高倍顯微鏡（×400）下，對陽性細胞進行計數(shù)，各自計數(shù)3張切片，每張切片上隨機選取5個視野。Wip1/PCNA表達按照陽性細胞百分率與陽性細胞染色強度得分之和進行計數(shù)。陽性細胞百分率分4個級別：≤5%計0分，＞5%～25%計1分，＞25%～50%計2分，＞50%計3分。細胞染色強度分數(shù)標準：無染色計0分，弱染色（淺黃色）計1分，中等染色（棕黃色）計2分，強染色（黃褐色）計3分。2項標準相和評分：0分為陰性（－），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中等陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗;相關性采用Spearman秩相關;使用Kaplan－Meier法繪制生存曲線并計算生存率;多因素分析使用Cox比例風險模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Wip1在人腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中表達Wip1陽性表達為胞漿和細胞核染成淺黃色、棕黃色或黃褐色，Wip1在腦膠質(zhì)瘤組織的陽性表達率為55.6%（45/81），明顯高于正常腦組織的0.0%（0/ 15），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=15.686，P＜0.01），見圖1。

2.2 Wip1在腦膠質(zhì)瘤各變量中的表達 在男女性別、腫瘤位置之間Wip1陽性率差異均無統(tǒng)計學意義;年齡≥50歲較 ＜50歲 Wip1陽性率高（P＜0.01）;腫瘤≥3 cm3較＜3 cm3Wip1陽性率高（P＜0.01）;卡氏功能狀態(tài)（Karnofsky performance status，KPS）評分＜80分較≥80分Wip1陽性率高（P＜0.05）;病理分級Ⅲ～Ⅳ級較Ⅱ級Wip1陽性率高（P＜0.01）;PCNA表達陽性較 PCNA表達陰性Wip1陽性率高（P＜0.05）;p53表達陰性較p53表達陽性Wip1陽性率高（P＜0.05）。見表1，圖2。

表1 W ip1在人腦膠質(zhì)瘤各變量中的表達Table 1 Relationship of Wip1 and clinicopathological characteristics in glioma patients （例數(shù)，%）

2.3 相關性分析 非參數(shù)Spearman等級相關性分析檢驗顯示W(wǎng)ip1與PCNA表達存在相關性（rs= 0.639，P＜0.01）。

2.4 Cox回歸模型分析 對入組的膠質(zhì)瘤患者自術后6～12個月開始進行隨訪，應用 Kaplan－Meier生存曲線分析得出：在低級別腦膠質(zhì)細胞瘤中Wip1陽性表達組生存率低于 Wip1陰性表達組（χ2= 4.260，P＜0.05）;在高級別腦膠質(zhì)瘤中Wip1陽性表達組生存率也低于 Wip1陰性表達組（χ2= 14.640，P＜0.01）。進一步行Cox回歸模型分析顯示低KPS評分、高Wip1表達、高病理分級是患者預后差的危險因素（均P＜0.05），見表2，3。

表2 Cox回歸賦值Table 2 Cox regression assignment

表3 Cox回歸模型分析Tab le 3 Cox regression model

3 討 論

Wip1存在于細胞核內(nèi)，是一種均一核內(nèi)蛋白，由PPM1D基因編碼，位于人染色體17q23，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為61 000。Wip1在正常小鼠細胞生長發(fā)育過程中，起重要調(diào)控作用，通過半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應方法和蛋白印跡技術檢測到小鼠胚胎及成體鼠體內(nèi)任何組織都有Wip1 mRNA的表達，尤其在睪丸中表達最高，并證實Wip1 mRNA在小鼠胚胎期組織內(nèi)表達量較成體明顯增高，這提示W(wǎng)ip1基因在細胞減數(shù)分裂和胚芽分化過程中具有重要作用。Wip1基因缺失對各種鼠腫瘤模型的形成均有抑制作用，其中包括腸息肉和B細胞淋巴瘤在內(nèi)的自發(fā)性腫瘤［10］。然而，高表達的Wip1能促使成纖維細胞轉(zhuǎn)化和加速轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤生長［11］。

本研究結(jié)果表明，Wip1在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達高于正常腦組織中的表達，并且隨膠質(zhì)瘤病理級別的增高Wip1表達呈高表達。然而，同級別但不同類型的腦膠質(zhì)細胞瘤之間Wip1陽性表達卻未發(fā)現(xiàn)差異，推測Wip1表達與膠質(zhì)瘤腫瘤細胞分化、發(fā)生發(fā)展密切相關。此外，我們發(fā)現(xiàn)Wip1高表達患者平均生存期短于Wip1陰性表達患者，Cox回歸分析顯示W(wǎng)ip1高表達是導致膠質(zhì)瘤患者平均生存期縮短的高危風險因素。

抑制腫瘤細胞增殖調(diào)控蛋白、活化腫瘤抑制蛋白和誘導腫瘤細胞凋亡是當前腫瘤生物治療的基本策略。Wip1在促進腫瘤細胞增殖方面，與其他原癌基因存在相互協(xié)同作用，能促使成纖維細胞轉(zhuǎn)化和加速轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤生長［12－13］。相反，Wip1基因敲除的小鼠能夠?qū)δ[瘤產(chǎn)生抵抗，甚至在Wip1基因敲除的荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長速度明顯減緩［14］。盡管目前對Wip1促進腫瘤生長的原因尚不明確，我們推測它可能通過某些通路促進腫瘤細胞增殖，依據(jù)實驗研究結(jié)果能夠得出，Wip1陽性表達組腫瘤組織體積大于Wip1陰性表達組，這種現(xiàn)象存在于高級別和低級別膠質(zhì)細胞瘤組織中;PCNA在正常腦組織中不表達，可作為細胞周期內(nèi)源性組織標記物，反映腫瘤細胞增殖活性指標，對分析判斷膠質(zhì)瘤增殖、分化及預后具有重要意義［15］。因此，我們選取PCNA作為研究對象，對Wip1促進腫瘤細胞增殖的可能機制進行了初步研究，結(jié)果顯示W(wǎng)ip1高表達的膠質(zhì)細胞瘤組織中PCNA表達明顯增高，據(jù)此，我們可以推測Wip1對腦膠質(zhì)細胞瘤的促進作用可能是通過促進腫瘤細胞增殖作用實現(xiàn)的。然而，Wip1在膠質(zhì)細胞瘤生長、增殖中最終所扮演的角色僅僅依靠組織學數(shù)據(jù)并不能夠說明問題，而是需要進一步通過細胞功能試驗或動物體內(nèi)實驗驗證Wip1對膠質(zhì)瘤細胞增殖及侵襲的作用。（本文圖見封二）

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（本文編輯：許卓文）

Overexpression of wild-type p53-induced phosphatase 1 relates poor prognosis of glioma patients

LIANG Chao－h(huán)ui，HU Fu－guang，ZHAO Lin，WANG Li－qun，JIAO Bao－h(huán)ua*
（ Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

Objective To explore whether wild－type p53－induced phosphatase 1（Wip1）relates with poor prognosis of patients with glioma.MethodsThe expression of Wip 1 in the brain tissue was examined using immunohistochemistry method in different grades of primary glioma（81 cases）and normal brain tissues（15 cases）.Analysis was made on the relationships between Wip1－positive patients and various clinicopathological characteristics including the gender，age，glioma pathological grade，tumor size，location，PCNA expression，p53 expression and Karnofsky performance status（KPS）score at the time of surgery.For survival analysis，we used the Kaplan－Meier method.ResultsThe expression of Wip1 in glioma samples was higher than that of normal brain tissues 55.6%（45/81）vs0.0%（0/15）（χ2=15.686，P＜0.01）.The survival rate of the glioma patients with positive Wip1 expression was significantly lower than that of the glioma patients with negative Wip1 expression.Wip1 was associated with the glioma pathological grade.The Wip1 expression was positive correlated with PCNA expression，Lower KPS score，Wip1 positive expression and higher pathology classification were risks for poor prognosis of glioma patients.ConclusionWip1 overexpression in brain glioma tissues was significantly associated with poor survival of glioma patients.

R739.4

A

1007－3205（2015）03－0273－04

2014－09－05;

2014－11－10

河北省醫(yī)學科學研究重點課題（20120065）

梁朝輝（1979－），男，河北平鄉(xiāng)人，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事腦膠質(zhì)瘤診治研究。

*通訊作者。E－mail：jiaobh2000@163.com

10.3969/j.issn.1007－3205.2015.03.008